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平成13年度 研究成果


1.第4四半期研究成果情報について

(1)論  文

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
清酒酵母の醸造特性に関する遺伝子の解析 下飯  仁  清酒酵母協会7号は35℃でパントテン酸要求性を示し、この性質は他の酵母との識別のために利用されている。我々は、 実験室酵母のECM31が協会7号のパントテン酸要求性を相補することを見出した。ECM31は、協会7号とそ の変異株の形質転換における選択マーカーとして利用可能である。清酒酵母は、発酵が盛んな時期に高泡を形成すること が知られている。我々は、高泡形成能を持つ清酒酵母から泡なし変異株に高泡形成能を付与する遺伝子をクローニングし 、AWA1と名づけた。解析の結果、AWA1はGPIアンカー型の細胞壁タンパク質をコードしていることがわか った。高泡形成酵母のAWA1を遺伝子破壊したところ、泡なしとなったことから、AWA1は高泡の形成に直接 関与しているものと考えられた。清酒酵母の変異株として高濃度のエタノールの存在下でも死滅しにくいエタノール耐性 酵母が育種されている。我々は、エタノール耐性酵母のエタノール耐性の原因を解明するために、DNAマイクロアレイを 用いて遺伝子発現プロファイルを解析した。その結果、エタノール耐性酵母では、熱やエタノールなどのストレス存在下 で発現する遺伝子群が高発現することによってエタノール耐性となっていることが明らかとなった。清酒酵母が含まれて いるSaccharomyces cerevisiaeは他の微生物に比べて強いエタノール耐性を持っているが、その詳しいメカニズム については不明な点が多い。我々は、染色体へのトランスポソンの挿入によってエタノール感受性となる変異株を検索し た結果、BEM2ROM2VPS34PAT1ADA2の変異がエタノール感受性をもたらすこ とを明らかにした。
(英文要旨)
 Sake yeast Kyokai no. 7 is a pantothenic acid auxotroph at 35℃, and this phenotype has been used to distinguish Kyokai no. 7 from other sake yeasts. We found that ECM31 of a Saccharomyces cerevisiae laboratory strain could complement the pantothenic acid auxotrophy of this yeast. Disruption of ECM31 in the laboratory strain resulted in pantothenic acid auxotrophy. ECM31 can be used as a selective marker in the transformation of Kyokai no. 7. Almost all sake yeasts form a thick foam layer on sake mash during the fermentation process. We have cloned a gene from a foam-forming sake yeast that confers foaming ability to a non-foaming mutant. This gene was named AWA1 and encodes a GPI anchor protein that is localized to the cell wall. An AWA1 disruptant showed a non-foaming phenotype in sake mash, indicating that Awa1p is required for the foam-forming phenotype. Several ethanol-tolerant mutants have been bred from industrial sake yeasts. We compared expression profiles between the ethanol-tolerant mutant and its parent sake yeast using DNA microarray. We found that several stress-induced genes were highly expressed even in the unstressed condition. We also found that the ethanol-tolerant mutant also exhibited resistance to other stresses including heat, high osmolarity and oxidative stress in addition to ethanol tolerance. The mechanism of ethanol tolerance in yeast Saccharomyces cerevisiae is thought to be regulated by many genes. To identify some of these genes, we screened for ethanol-sensitive mutants among a collection of mutants obtained using transposon mutagenesis. By this method, we identified the BEM2, PAT1, ROM2, VPS34 and ADA2 genes whose disruption resulted in ethanol sensitivity. We also found that the integrity of the cell wall plays an important role in ethanol tolerance in S. cerevisiae.
[生物工学会誌 80(2), 64-69, 2002]


(2)研究成果

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
Production of Cellulose- and Xylan-Degrading Enzymes by a Koji Mold, Aspergillus oryzae, and Their Contribution to the Maceration of Rice Endosperm Cell Wall Y. Yamane, J. Fujita, R. Shimizu, A. Hiyoshi, H. Fukuda, Y. Kizaki, and S. Wakabayashi
(山根雄一、田 仁、清水隆一、日吉 智、福田 央、木崎康造、若林三郎)
 The production of cellulose-(CEL), xylan-(XYL), and pectin-degrading enzymes (PEC) by a koji mold, Aspergillus oryzae, was studied, and their contribution to the maceration of the rice endosperm cell wall were investigated with regard to the utilization of available rice in the sake mash. The sake koji mold showed higher CEL and XYL productivities, whereas the miso and soy sauce koji molds showed higher PEC productivity. Statistical analyses indicated that CEL and XYL contribute predominantly and synergistically to the maceration of the rice endosperm cell wall. A. oryzae produced at least three kinds of CEL (Cel-1,2,3) and two kinds of XYL (Xyl-1,2) when cultured in a wheat bran medium. In the solid-state culture, the production of Cel-3 and Xyl-2 was markedly stimulated by decreasing the moisture content of the solid substrate, although the production levels of Cel-1 and Xyl-1 were almost the same. These data suggest that the production of Cel-3 and Xyl-2 is strongly influenced by culture conditions, and that water activity is one of the dominant factors in the regulation of their production.
(和文要旨)
 清酒もろみでの原料利用率の向上を目的とし、麹菌Aspergillus oryzaeによるセルロース、キシラン、 及びペクチン分解酵素の生産特性と、これらの酵素の米細胞壁溶解への寄与を検討した。清酒麹からの分離株が 味噌、及び醤油麹からの分離株よりもセルロース分解酵素、及びキシラン分解酵素について高い生産性を示した 反面、味噌及び醤油麹からの2株はペクチン分解酵素について高い生産能を示した。統計解析の結果、セルロー ス分解酵素及びキシラン分解酵素が、米細胞壁の溶解に主たる寄与を為しているものと考えられた。この両酵素 の生産性についてさらに検討したところ、麹菌はセルロース分解酵素については少なくとも3タイプ(Cel-1,2,3)、 キシラン分解酵素については少なくとも2タイプ(Xyl-1,2)を生産するものと考えられた。固体培養では、Cel-3及び Xyl-2の生産性は培地の水分含有量の減少によって顕著に増加したが、Cel-1 と Xyl-1は同じであった。これらの結 果は、Cel-3及びXyl-2の生産性は培養条件に強く影響され、水分活性がそれらの生産性の制御に関する有力な要因の 一つであることを示している。
[J. Biosci. Bioeng. 93, 9-14, 2002]
デオキシグルコース耐性株からのリンゴ酸高生産清酒酵母の分離 水野昭博、岩淵正文、木曽邦明、佐藤和夫、高橋利郎  協会14号の2-デオキシグルコース耐性株からリンゴ酸生産能の高い自然変異株を得た。得られた変異株を用いて 100kgのパイロットスケールの清酒醸造試験を行い、高いリンゴ酸生成能を確認した。また、製成酒の官能評価 において、2-デオキシグルコース耐性株による製成酒は味がなめらかとの指摘が多く、対照の親株を用いた仕込みよ り総合品質は高かった。
[日本醸造学会誌 97, 228-233, 2002]
Critical Importance of α-Glucosidase Contained in Rice Kernel for Alcohol Fermentation of Rice Polish
(白糠のアルコール発酵における米α-グルコシダーゼの重要性について)
H. Iwata, T. Suzuki, K. Takahashi, and I. Aramaki
(岩田 博、鈴木利明、高橋和秀、荒巻 功)
 In our previous study, we proposed a new alcoholic beverage called nuka-sake, which is made from uncooked rice polish without any enzyme source such as koji. In nuka-sake brewing, the uncooked rice polish serves not only as the fermentation material but also as the enzyme source. In the present study, the results of both laboratory-scale nuka-sake brewing runs with various grades of rice polish and analysis of amylolitic enzyme distribution in rice polish suggested that α-glucosidase (EC 3.2.1.20) is a key enzyme of parallel fermentation in nuka-sake brewing. Miglitol, a specific inhibitor of α-glucosidase, strongly inhibited glucose production from rice polish. To obtain further evidence regarding the contribution of α-glucosidase, this enzyme was purified from rice grain kernels (Yamadanishiki cultivar) and supplied for both rice polish saccharification and nuka-sake brewing. The purified α-glucosidase promoted both glucose production from rice polish and alcohol fermentation in nuka-sake brewing. Based on these results, it was considered that the α-glucosidase contained in rice polish plays an important role in glucose production. This role may be a rate-limiting factor for parallel fermentation in nuka-sake brewing. Moreover, oligosaccarides accumulated during the saccharification of uncooked rice polish, implying the contribution of not only α-glucosidase but also α-amylase (EC 3.2.1.1). Through this result, it can be speculated that the starch contained in rice polish will be decomposed to glucose as a result of the action of α-glucosidase and α-amylase contained in rice polish.
(和文要旨)
 前報で、我々は麹のような酵素源を使用しないで無蒸煮白糠が発酵することことを見出し、糠酒と名付けた。糠酒発酵において、 無蒸煮白糠は発酵の基質のみならず酵素源ともなっていた。今回、種々精白度の白糠を使用した実験室規模での糠酒発酵試験と糠糖 質関連酵素の分布分析結果から、α-グルコシダーゼ(EC3.2.1.20)が、糠酒の平行複発酵におけるキー酵素であると推定した。また、 α-グルコシダーゼの特異的阻害剤であるミグリトールも白糠からのグルコース生成を強く阻害した。α-グルコシダーゼの働きをよ り詳細に検討するため、この酵素を山田錦から精製し、白糠の糖化試験と糠酒発酵試験に使用した。その結果、精製されたα-グルコ シダーゼは、白糠からのグルコース生成と糠酒発酵を促進した。以上の結果から、白糠に含まれるα-グルコシダーゼがグルコース生 成において重要な働きをし糠酒発酵の制限要因ともなっていると考えられた。更に、白糠の糖化中に少量のオリゴ糖の蓄積が見られる ことから、白糠デンプンは、白糠に含まれるα-グルコシダーゼとα-アミラーゼの働きによりグルコースにまで分解されていると推定 された。
[J. Biosci. Bioeng. 93, 296-302, 2002]


(3)公 開 特 許

出願番号  :特許出願2000-232542
出願日   :2000年8月1日
公開番号  :特許公開2002-045166
公開日   :2002年2月12日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :若林三郎 他6名
       株式会社醉心山根本店
       天野エンザイム株式会社
発明の名称 :芳香性酒類の製造法
【解決手段】
 カプロン酸エチルの生成量を高め、精米割合が低くとも芳香性に優れた酒類を安価かつ量産可能に製造できる芳香性酒類の醸造法を提供すること。
【効果】
 本発明の芳香性酒類の醸造法は、リパーゼ又はリパーゼを含有する酵素剤を醪に添加して発酵させながら酒類中のカプロン酸エチルの含有量を 高めさせる。リパーゼはバークホルデリア(Burkholderia)由来のリパーゼとしてもよく、留仕込み後5日目?15日目にリパーゼ又はリパーゼを 含む酵素剤を添加してもよく、さらに酵母は協会no.86号酵母((財)日本醸造協会製)としてもよい。
出願番号  :特許出願2000-246492
出願日   :2000年8月15日
公開番号  :特許公開2002-058484
公開日   :2002年2月26日
出願人   :国税庁長官
発明者   :福田 央、若林三郎
発明の名称 :泡無し酵母の育種法
【解決手段】
 MNN4遺伝子を導入し、これを発現せしめることによる泡無し酵母の育種法。
【効果】
 効率よく泡無し酵母を分離、採取することができ、得られた新規泡無し酵母を使用することにより、泡を発生せしめることなくないしは泡の生成を 低下抑制しながら、効率的に酒類を製造することができる。


2.第3四半期研究成果情報について

(1)研 究 成 果 情 報

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
Characterization of The Cellulose-Binding Ability of Geotrichum sp. M111 Cells and Its Application to Dehydration of The Distilled Waste of Sweet Potato Shouchu
Geotrichum属酵母M111菌体のセルロース結合特性と芋焼酎蒸留廃液の脱水への応用)
H. Yoshii, T. Furuta, M. Ikeda, T. Ito, H. Iefuji, and P. Linko
(吉井英文、古田 武、池田美幸、伊藤隆孝、家藤治幸、Pekka. Linko)
 The cellulose-binding ability of Geotrichum sp. M111 cells was investigated by the micro-tube method which gives an indication of the binding ability of M111 cells. The optimum pH value and temperature were 3-7 and below 50℃, respectively, from measurement of the aggregation height for a mixture of cellulose powder and M111 cells. The binding constant of 0.3% for M111 cells to cellulose powder was obtained in a 20 mM citrate buffer of pH 5.0 at 30℃. Aggregation was inhibited by such surfactants as sodium dodecylsulfate. The binding ability of M111 cells to cellulose fiber disappeared after a treatment with Driselase or Pronase E. This suggests that the binding ability might be related to the cell surface proteins. The dehydration rate of the distilled waste of sweet potato shouchu was accelerated by a linear viscoelastic model suggests that the acceleration effect might have been due to the space increase between cellulose fibers with the cell addition.
Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 2187-2192, 2001]

(和文要旨)
 Geotrichum属酵母M111菌体のセルロース結合能を、ミクロチューブ法を用いて検討した。M111菌体セルロース結合定数は、 20mM、クエン酸緩衝液、pH5の条件で、0.3%が得られた。菌体のセルロース結合能は、SDSによって阻害を受けた。菌体のドリセラ ーゼ、プロナーゼE溶液処理により、セルロース結合能が消失し、菌体表層タンパク質のセルロース結合能への寄与が示唆された。 芋焼酎蒸留廃液の脱水過程へのM111添加による脱水速度促進は、線形粘断性モデルによりセルロース空隙の増加により説明できた。
Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 2187-2192, 2001]
Purification and Characterization of a O-Methyltransferase Capable of Methylating 2-Hydroxy-3-alkylpyrazine from Vitis vinifera L.(cv. Cabernet Sauvignon)
(ブドウ(カベルネ・ソービニヨン種)からの2-ハイドロキシ-3-アルキルピラジンに対するメチル化能を有するO-メチル基転移酵素の精製と性質)
K. Hashizume, K. Tozawa, Y. Hiraga, and I. Aramaki
(橋爪克己、戸澤一幸、平賀良知、荒巻 功)
 An S-adenosyl-L-methionine-dependent O-methyltransferase capable of methylating 2-hydroxy-3-alkylpyrazine (HP) was purified 7,300-fold to apparent homogeneity with an 8.2% overall recovery from Vitis vinifera L. (cv. Cabernet Sauvignon) through a purification procedure including column chromatography on DEAE-Sepharose FF, Ether-5PW, hydroxyapatite, G2000SWXL, and DEAE-5PW. The relative molecular mass of the native enzyme estimated on gel permeation chromatography was 85 kDa, and the subunit molecular mass was estimated to be 41 kDa on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The enzyme also methylates caffeic acid. The Vmax for IBHP and caffeic acid were 0.73 and 175 pkatals/mg, respectively, and the respective Km for IBHP and caffeic acid were 0.30 and 0.032 mM. The optimum pH for IBHP (8.5) was different from that for caffeic acid (7.5).
Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 2213-2219, 2001]

(和文要旨)
 ブドウ(カベルネ・ソービニヨン種)から2-ハイドロキシ-3-アルキルピラジン(HP)に対するメチル化能を有するS-アデノシルメ チオニン依存性のO-メチル基転移酵素を陽イオン交換、疎水及びゲルろ過の各種クロマトグラフィー、及びハイドロキシアパ タイト処理によって電気泳動的に均一に精製し、その性質を調べた。精製酵素の分子量はゲルろ過で85kDa、SDS-PAGEで41kDaであっ た。本酵素はコーヒー酸に対して活性を有しており、2-ハイドロキシ-3-イソブチルピラジンと比較してコーヒー酸を基質とした場合 のmaxは大きく、m値は小さかった。また、両基質に対する至適pHも異なっていた。
Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 2213-2219, 2001]
Lipase catalyzed methanolysis of vegetable oils in aqueous medium by Cryptococcus spp. S-2
Cryptococcus spp. S-2 による植物オイルの水溶液系におけるリパーゼ触媒加メタノール分解)
N. R. Kamini and H. Iefuji
(Numbi. Ramudu. Kamini、家藤治幸)
 A number of factors affecting the methanolysis of vegetable oils in aqueous medium by Cryptococcus spp. S-2 lipase were investigated. The crude lipase from the yeast efficiently catalyzed the methanolysis of vegetable oils (oil/methanol molar ratio of 1:1) in the presence of 40 wt.% water. The methyl ester content was high with rice bran oil at 30℃ for 96 h and further optimization studies were carried out with varying amount of enzyme, water or methanol. The enzyme was not inactivated by shaking in a mixture containing 4 Meq of methanol against the oil and 100 wt.% water by weight of the substrate and the methyl ester contents increased with increasing molar equivalents of methanol and water contents from 60 to 100 wt.%. The optimal methanolysis conditions were an oil/methanol molar ratio of 1:4, a water content of 80 wt.% by weight of the substrate containing 2000 U of crude lipase with shaking at 160 rpm for 120 h at 30℃. Thus, the reaction was conducted in a single step to avoid the stepwise addition of methanol and the methyl ester contents reached 80.2 wt.% at 120 h. These same conditions were applied for alcoholysis of rice bran oil and primary alcohols to their respective alkyl ester derivatives which are excellent substitutes for diesel fuel.
Process Biochem. 37, 405-410, 2001]

(和文要旨)
 Cryptococcus sp. S-2の生産するリパーゼによる、米糠油、メタノール、水、酵素混合液でのメチルエステル 生成反応について検討した。本酵素は米糠油1モルに対してメタノール4モルを加える条件においても酵素の失活は見ら れず、かつ米糠油と等量の水分存在下においても良好なエステル生成が見られた。油脂/メタノール=1:4、水分含量 (対油脂)80%の条件で、酵素活性2,000ユニット、160rpm、30℃、120時間のワンステップ反応により、80.2%の収率で 脂肪酸メチルエステルを生産することができた。
Process Biochem. 37, 405-410, 2001]
Shochu brewing characteristics and properties of a trichothecin-resistant shochu yeast mutant
(トリコセシン耐性焼酎酵母の醸造特性と諸性質)
H. Fukuda, Y. Kizaki, T. Tsukihashi and S. Wakabayashi
(福田 央、木崎 康造、月橋 孝之、若林 三郎)
 An antibiotic-resistant strain of Saccharomyces cerevisiae was isolated from shochu yeast. Three mutants were used for shochu brewing and gave higher ethanol productivities than the parent. The mutants were resistant to cycloheximide, cerulenin, trichothecin and other organic compounds such as lauric acid. In the presence of 20% (v/v) ethanol, the viability of the mutants was 87-96%, but that of the parent was 77%. Zymolyase treatment for 3 h, decreased the viability of the parent by 44% but that of the mutants only by 11-32%. Thus the higher ethanol productivity of these mutants is related to their high ethanol tolerance and resistance to various organic compounds.
Biotechnology Letters 23 (24), 2009-2013, 2001]

(和文要旨)
 焼酎酵母から抗生物質耐性株を分離し、親株よりアルコール生産能の高い変異株を3つ取得した。これら変異株は、シク ロヘキシミド・セルレニン・トリコセシン及びラウリン酸等の有機化合物について耐性が向上していた。20%アルコール存 在下において、変異株の生存率は、87-96%に対し、親株のそれは、77%であった。また、3時間のザイモリエ−ス処理により 、親株の生存率は、44%であったが、変異株のそれは、11-32%であった。このような結果から、これら変異株のアルコール 生産性の向上は、アルコール及び各種有機酸に対する耐性が向上したことに関係していると考えられた。

(2)公 開 特 許

出願番号  :特許出願2000-156284
出願日   :2000年5月26日
公開番号  :特許公開2001-333762
公開日   :2001年12月4日
出願人   :国税庁長官
発明者   :佐藤和夫 他1名
発明の名称 :麹菌と酵母の固体混合培養による酒類の製造
【解決手段】
 蒸し米そのほかの穀類原料に麹菌胞子もしくは麹菌培養液と酵母培養液もしくは乾燥酵母菌体を散布し、混合培養状態で麹 菌の酵素生産と酵母菌体増殖を同時に行うことによって、麹菌による各種酵素の生産とアルコール発酵を行うための酵母の増 殖とを同時に行う、酒類製造用麹の製造方法。
【効果】
 通常の酒類の酒母、もろみの製造に十分な量の酵母を麹菌と同時に培養することができ、酒母製造を省略してもろみを製造 することが可能となった。したがって、本発明に係る混合固体培養麹によれば、酒類製造において効率的且つ製造コストの大 幅削減と高品質化が可能となる。



3.第2四半期研究成果情報について

(1)研 究 成 果 情 報

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
米α-グルコシダーゼ活性と理化学特性値との関係 岩田 博、岩瀬新吾、高浜圭誠、松浦宏行、猪谷富雄、荒巻 功  米のα-グルコシダーゼ活性と食味と関連のある理化学的性質との関係を明らかにするため、1997年産の24種類の米の α-グルコシダーゼ活性と他2種の糖化関連酵素活性及び理化学的性質の測定を行った。α-グルコシダーゼ活性は,コシヒカ リとあきたこまち(現代品種)が、赤米(対馬)や神力(旧品種)より高かった。一方、α-アミラーゼ活性は、赤毛(旧品 種)と赤米(種子島)がコシヒカリより高かった。α-グルコシダーゼ活性は、炊飯特性試験のヨード呈色度、溶出固形分、 膨張容積及びアミロース含量と負の相関(r=-0.542, r=-0.570, r=-0.460, r=-0.487)があった。また、α-グルコシダーゼ 活性はRVAを用いた粘度特性試験の最高粘度、ブレークダウンと正の相関(r=0.557, r=0.633)があった。これらから、間 接的ではあるがα-グルコシダーゼ活性と食味は相関があると推定された。主成分分析を行った結果、第1主成分はアミロー スに関する成分を、第2主成分は還元糖に関する成分を示すことが分かった。これらの2つの主成分を軸として主成分得点を プロットすると、第1主成分はアミロースを示すとともに米の品種の年代をも示しているように思われた。更に、この第1主 成分に対し、α-グルコシダーゼが0.778という高い主成分負荷量を持ったので、α-グルコシダーゼのアミロペクチン合成への 何らかの関与が示唆された。
[日本食品科学会誌 48, 482-490, 2001]
植物細胞壁溶解酵素の添加による清酒もろみにおける原料利用率の向上
(Improvement of Material Utlization in Sake Moromi Brewing by Addition of Cell Wall Macarating Enzymes.)
福田央、日吉智、砂川英之、田中健太郎、藤田 仁、山根雄一、若林三郎
(H. Fukuda, A. Hiyoshi, H. Sunagawa, K. Tanaka, J. Fujita, Y. Yamane, and S. Wakabayashi)
 清酒もろみの原料利用率の向上を目的とし、セルロース、キシラン、及びペクチン等の、いわゆる植物細胞壁溶解酵素が、 清酒もろみの並行複発酵に及ぼす影響を検討した。セルロース、キシラン、及びペクチン溶解酵素を有する市販酵素剤の添加 により、アルコール収得量も増加し、原料利用率の向上が得られた。更に、麹菌の培養上清液よりアミラーゼ・プロテアーゼ を除き、セルロース、キシラン、及びペクチン溶解活性の高い粗酵素液を調整し、もろみ発酵試験に供した。この結果、もろ み発酵・原料利用率ともに顕著に向上したことから、これらの植物細胞壁溶解酵素が、清酒もろみにおいて並行複発酵の促進 効果を有することが強く示唆された。
[生物工学会誌 79(8), 299-302, 2001]
AFLP analysis of type strains and laboratory and industrial strains of Saccharomyces sensu stricto and its application to phenetic clustering
Saccharomyces sensu stricto のタイプストレイン、実験室株及び実用株のAFLP解析及びその表型解析への利用)
M. Azumi and N. Goto-Yamamoto
(安住政俊、後藤(山本)奈美)
 Using nine primer pairs, amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis was conducted to characterize industrial, laboratory, and type strains of Saccharomyces sensu stricto. S. cerevisiae, S. bayanus, S. carlsbergensis, and S. paradoxus had species-specific AFLP profiles with some variations among the strains. Nineteen wine, ale, bakery, whisky, and laboratory strains of S. cerevisiae were differentiated by two primer pairs, while, out of 19 strains of sake yeast, two groups consisting of two and eight strains were not differentiated using nine primer pairs. A phenogram of 41 strains of S. cerevisiae, two strains of S. bayanus, the type strain of S. pastorianus, three strains of S. carlsbergensis, one hybrid strain of S. cerevisiae and S. bayanus, and the type strain of S. paradoxus was obtained by the unweighted pair group method using arithmetic averages (UPGMA) based on the percentage of shared AFLP fragments of each sample pair. This phenogram demonstrated clear separations of S. cerevisiae, S. bayanus, S. carlsbergensis, and S. paradoxus . However, S. pastorianus ATCC 12752T showed highest percentages of shared fragments with the strains of S. bayanus, and formed a cluster with them. Except for the type strain of S. pastorianus, the percentages of shared fragments showed a similar tendency with reported data of DNA relatedness. The cluster of S. cerevisiae separated into three subclusters: a cluster consisting of sake and shochu strains, and a whisky strain; a cluster consisting of bakery, wine, ale, and whisky strains; and a cluster consisting of laboratory strains.
Yeast 18 (12), 1145-1154 , 2001]
Identification of genes required for growth under ethanol stress using transposon mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae.
(トランスポゾン変異を用いたSaccharomyces cerevisiaeのエタノールストレス存在下での増殖に必要な遺伝子の同定)
T. Takahashi, H. Simoi, K. Ito
(高橋俊成、下飯 仁、伊藤 清)
 The yeast Saccharomyces cerevisiae exhibits high ethanol tolerance compared with other microorganisms. The mechanism of ethanol tolerance in yeast is thought to be regulated by many genes. To identify some of these genes, we screened for ethanol-sensitive S. cerevisiae strains
among a collection of mutants obtained using transposon mutagenesis. Five ethanol-sensitive (ets) mutants were isolated from approximately 7,000 mutants created by transforming yeast cells with a transposon (mTn-lacZ/LEU2)-mutagenized genomic library. Although these mutants
grew normally in a rich medium, they could not grow in the same medium containing 6% ethanol. Sequence analysis of the ets mutants revealed that the transposon was inserted in the coding regions of BEM2, PAT1, ROM2, VPS34 and ADA2. We constructed deletion mutants for these genes by a PCR-directed disruption method and confirmed that the disruptants, like the ets mutants, were ethanol sensitive. Thus, these five genes are indeed required for growth under ethanol stress. These mutants were also more sensitive than normal cells to Calcofluor white, a drug that affects cell wall architecture, and Zymolyase, a yeast lytic enzyme containing mainly beta-1,3- glucanase, indicating that the integrity of the cell wall plays an important role in ethanol tolerance in S. cerevisiae.
Mol. Genet. Genomics 265(6),1112-1119, 2001]


(2)公 開 特 許

出願番号  :特許出願2000-68227
出願日   :2000年3月13日
公開番号  :特許公開2001-252072
公開日   :2001年9月18日
出願人   :国税庁長官
発明者   :家藤治幸 他3名
発明の名称 :酵母由来の新規リパーゼCS2
【解決手段】
Cryptococcus sp. S-2(FERMP-15155)の培養液から新規リパーゼCS2を分離、採取する。
【効果】
リパーゼCS2は、油脂分解能が高いだけでなく、弱酸性〜アルカリ性の広い範囲で強い油脂分解性を示し、 更に有機溶媒に安定であるという特質を有している。したがって、薬品、飲食品、洗剤等従来からのリパー ゼの用途のほかに、エステル合成反応といった新しい用途も期待できる。



3.第1四半期研究成果情報について

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
Sake brewing characteristics of a new type of cerulenin-resistant sake yeast mutants
(新規なセルレニン耐性清酒酵母の清酒醸造特性)
H. Fukuda, Y. Kizaki, T. Ishikawa and K. Takahashi
(福田央,、木崎康造、石川雄章、高橋康次郎)
 Several new types of cerulenin-resistant mutants of sake yeast were isolated. These mutants showed respiratory deficiency and could grow on media containing a higher concentration of antibiotics than could the parents. Sakes brewed by the mutants produced less succinate than by both the parent yeast and the mutants with respiratory deficiency induced by ethidium bromide. In addition, the acidity of these mutants was decreased. Since low acidity is favorable in both sake and wine, these mutants might be applicable for both sake and wine brewing.
Biotechnology Letters 23: 717-721, 2001]
Critical importance of phytase for yeast growth and alcohol fermentation in Japanese sake brewing
(清酒醸造における酵母の増殖及び発酵に対するフィターゼの重要性について)
J. Fujita, H. Fukuda, Y. Yamane, Y. Kizaki, S. Shigeta, K. Ono, O. Suzuki, and S. Wakabayashi
(藤田 仁、福田 央、山根雄一、木崎康造、重田征子、小埜和久、鈴木修、若林三郎)
 The high phytase producing mutant of Aspergillus oryzae (KL-38) previously isolated was employed for koji making, and the produced koji rice then supplied for sake brewing. The alcohol fermentation was improved compared to that with the parent strain (A. oryzae BP-1). The effect of two phytase isozymes (Phy I and Phy II) produced by A. oryzae on yeast growth and inorganic phosphate liberation were investigated using a synthetic medium containing by the combination of Phy I and Phy II at a ratio of 1 to 3, which was compatible with the production ratio in KL-38. Based on these results, phytase plays important role in sake brewing, and that the maximum inorganic phosphate liberation from phytic acid can be obtained by a suitable combination of Phy I and Phy II.
Biotechnology Letters 23: 867-871, 2001]
市販ワイン酵母の種の同定と醸造特性間の相関 JEONG. Seok. Tae、後藤(山本)奈美 1.市販ワイン酵母25株の種を同定したところ、S. cerevisiaeS. bayanusの交雑株と報告されているS6U以外の供試菌株は、 S. bayanusと表示されている3株を含め、すべてS. cerevisiaeであった。
2.市販ワイン酵母を用いて小仕込み試験を行ったところ、赤ワインのアントシアニン量の指標であるA520 at pH 0.25と、A420、総フェノール 及びフラボノイド・フェノール濃度の間に有意な正の相関が見出され、酵母による果皮成分の抽出効率の違いが示唆された。また、生成酒の亜 硫酸濃度とアセトアルデヒド濃度の間に正の相関が認められた。酵母の沈降速度の指標とした懸濁9日後の表面から6cmのA660と比重及びグリセロ ール濃度の間に有意な正の相関が見出され、凝集性のない酵母の沈降速度の違いは、球形粒子の沈降速度と同様、ワインの比重と粘性率によって 説明されると考えられた。
J. ASEV Jpn. 12 (1), 10-20, 2001]
S-Adenosyl-L-methionine-dependent O-Methylation of 2-Hydroxy-3-alkylpyrazine in Wine Grapes: A Putative Final step of Methoxypyrazine Biosynthesis
(ワインブドウ中のメトキシピラジン生合成の最終段階と推定される2-ハイドロキシ-3-アルキルピラジンのS-アデノシル-L-メチオニン依存性O-メチル化反応)
K. Hashizume, K. Tozawa, M. Endo, and I. Aramaki
(橋爪克己、戸澤一幸、遠藤雅之、荒巻功)
 The final step of 2-methoxy-3-alkylpyrazine (MP) biosynthesis has been presumed to involve O-methylation of 2-hydroxy-3-alkylpyarzine (HP), although this reaction has never been demonstrated in organisms. We detected 2-hydroxy-3-isobutylpyrazine (IBHP) and 2-hydroxy-3-isopropylpyrazine (IPHP) in unripe grapes, and S-adenosyl-L-methionine-dependent O-methyltransferase (OMT) activity toward HP in crude extracts from young shoots and unripe grapes that accumulate MP at different levels. The levels of HP in the berries and stems were estimated by using 2-hydroxy-3-sec-butylpyrazine as an internal standard. The OMT activity observed in the crude extracts from young shoot and berries was extremely low, but no MP-decomposing activity was detected in the solutions. The levels of HP and OMT activity were closely related with the level of MP in the grapes. These results indicate that the predicted final step of MP biosynthesis exists in wine grapes.
Biosci. Biotechnol. Biochem. 65 , 795-801, 2001]
Beer Brewing using a Fusant between a Sake yeast and a Brewer's Yeast
(清酒酵母とビール酵母との細胞融合株によるビール醸造)
N. Mukai, C. Nishimori, I. F. Wilson, A. Mizuno, T. Takahashi, and K. Sato
(向井伸彦、西森千晴、ウィルソン 藤重郁子、水野昭博,高橋利郎、佐藤和夫)

 Beer brewing using a fusant between a sake yeast (a lysine auxotrophic mutant of sake yeast K-14) and a brewer's yeast (a respiratory-deficient mutant of the top fermentation yeast NCYC1333) was performed to take advantage of the beneficial characteristics of sake yeasts, i.e., the high productivity of esters, high tolerance to ethanol, and high osmotolerance. The fusant (F-32) obtained was different from the parental yeasts regarding, for example, the assimilation of carbon sources and tolerance to ethanol. A brewing trial with the fusant was carried out using a 100-l pilot-scale plant. The fusant fermented wort more rapidly than the parental brewer's yeast. However, the sedimentation capacity of the fusant was relatively low. The beer brewed using the fusant contained more ethanol and esters compared to that brewed using the parental brewer's yeast. The fusant also obtained osmotolerance in the fermentation of maltose and fermented high-gravity wort well.
[J. Biosci. Bioeng. 91, 482-486, 2001]
醤油色度について・・・麹菌からのアプローチ・・・(その2)
醤油麹菌のキシロシダーゼについて
橋本忠明、森下めぐみ、中田佳幸、辻安信、伊藤清  醤油麹菌Aspergillus oryzae HL15 株は、醤油麹において、少なくとも3種類のキシロシダーゼを生産した。それらを精製したとこ ろ、醤油諸味中でも機能し得る耐塩性の酵素であった。また、キシロシダーゼは液体培養すると菌体結合型酵素として生産されていた。キシロ シダーゼと同時にキシラナーゼを作用させると、効率よくキシランを分解した。
[醤研27, 125-130, 2001]



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