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平成20年度 研究成果


1.第4四半期研究成果情報について

(1)研究成果

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
ブドウ'紫'と'甲州'のSSR解析およびアントシアニン分析による比較
(Comparison of 'Murasaki' and 'Koshu' Grape Cultivars Using Simple Sequence Repeat and Anthocyanin Analysis)
後藤(山本)奈美、沼田美子代、島本 敏、望岡亮介、細見彰洋
(Nami GOTO-YAMAMOTO, Mineyo NUMATA, Toshi SHIMAMOTO, Ryosuke MOCHIOKA, and Akihiro HOSOMI)
 '紫'は日本の古い在来品種であると言われているが、一方で'紫'は'甲州'と同じ品種であるという説もある。現在、'紫'は大阪府環境農林水産総合研究所に保存されている1樹のみが知られている。この'紫'は'甲州'と26のSSR遺伝子座で同じ結果を示した。2006年の'紫'は酒類総合研究所の'甲州'よりも若干マルビジン3−グルコシド含量が高かったが、'紫'のアントシアニン含量は'甲州'の年、栽培地、およびおそらくはクローンが異なる場合のアントシアニン含量の範囲の中にあった。従って、現在保存されている'紫'は'甲州'と同じか、少なくとも非常に近い品種であると言える。
(英文要旨)
 It has been said that 'Murasaki' is an old native Japanese grape cultivar that is almost extinct, but also, contradictory to this, it has been stated that 'Murasaki' is in fact the same cultivar as 'Koshu'. At present, only one vine of 'Murasaki' is preserved in the Research Institute of Environment, Agriculture and Fisheries, Osaka Prefecture. This 'Murasaki' vine showed the same simple sequence repeat (SSR) profile as 'Koshu' for 26 SSR loci. Berry skin of 'Murasaki' showed slightly higher malvidin 3-glucoside concentration than that of 'Koshu' of the National Research Institute of Brewing in 2006. However, the anthocyanin concentration of 'Murasaki' was within the range of that of 'Koshu' from different locations, of different years, and probably of different clones. Thus, it appears that the conserved 'Murasaki' is the same as, or at least very similar to, 'Koshu'.
【日本ブドウワイン学会誌、19、114-118、(2008)】
清酒の硫黄化合物含量と貯蔵によるポリスルフィド生成の関係
(Relationship between the concentrations of nitrogen/sulfur compounds in sakes before storing and those of polysulfides in sakes after storing)
奥田将生、磯谷敦子、上用みどり、後藤奈美、三上重明
(Masaki Okuda, Atsuko Isogai, Midori Joyo, Nami Goto-Yamamoto and Shigeaki Mikami)
 鑑評会の出品酒を実験材料として、窒素(N)や硫黄(S)含量と50℃1ヶ月間貯蔵後のポリスルフィド生成量の関係を検討した。清酒中のNとS含量には強い正の相関関係がみられ、清酒中の硫黄化合物はその多くは原料米のタンパク質に由来することが推察された。また、全硫黄化合物の2〜5割がアミノ酸であることがわかった。50℃1ヶ月貯蔵により生成するポリスルフィドについて、DMDSは全試料で検知閾値以下であったが、DMTSは約半数の試料において検知閾値を上回った。貯蔵前清酒中の成分との関係において、DMTS、DMDS含量は、全N及びS含量、アミノ酸態のNやS含量に有意な正の相関関係がみられた。各成分間の偏相関分析の結果、着色度の増加には全Nとグルコース含量が深く関係するのに対し、ポリスルフィドの生成にはアミノ酸態のS含量が深く関係することが示唆された。以上から、硫黄化合物の多い清酒は老香が生じやすいというこれまでの推定を成分的に裏付ける結果が得られた。
(英文要旨)
 Using the sake samples presented at a sake contest in 2006, we investigated the relationships between concentrations of nitrogen/sulfur compounds before the storage of sake and concentrations of polysulfides (DMTS, DMDS) which are the main aroma compounds responsible for "hineka" in sake after the storage of sake, for a month at 50℃. The concentrations of total nitrogen in the sakes exhibited significantly positive correlations with the concentrations of sulfur compounds in the sakes. This result appeared to show that most of the sulfur compounds are derived from rice proteins. The ratio of sulfur of the amino acid formed against total sulfur averaged. 27.6% (min.17〜max.45%) in the sake samples. After storing the sake samples, the concentrations of DMDS were the below detection threshold in all samples, and those of DMTS were above the detection threshold in half of the samples. The concentrations of polysulfides in the sakes after storing showed significant positive correlations with concentrations of sulfur compounds in the sakes before storing. Moreover, a partial correlation analysis showed that the concentration of amino acid containing sulfur had a significant positive correlation with that of polysulfide. These results suggest that sake containing high concentrations of sulfur compounds can produce a high concentration of polysulfide after storage for long periods.
【日本醸造協会誌、104、131-141、(2009)】
酒造用原料米、市販清酒および酒粕中のカドミウム
(The content of cadmium in rice, sake, and sake cake)
後藤邦康
(Kuniyasu GOTO)
 酒米47点、市販清酒および酒粕各25点中のカドミウム(Cd)濃度を測定した。試料は硝酸と過酸化水素を用いたマイクロ波分解装置により調整し、誘導結合プラズマ発光分析装置(ICP-AES)により分析を行った。測定した酒造用玄米、70 %精白米および市販酒粕中のCd濃度は平均でそれぞれ29.9,25.3,154.7 μg/kg、市販清酒中のCd濃度は1.29 μg/lであった。70 %精白米中のCd濃度は玄米の約78 %(7試料の平均値)となった。以上の結果から、精米工程によるCd濃度の減少効果は少なく、また原料米中のCdは清酒へはほとんど移行せず、酒粕に移行する可能性が示された。
(英文要旨)
 The cadmium (Cd) content in 47 strains of rice for brewing sake, 25 commercial sakes, and 25 commercial sake cakes was measured. The samples were prepared by microwave digestion using HNO3 and H2O2, and then analyzed by an inductively coupled sequential plasma spectrometer (ICP-AES). The Cd content in brown rice, 70% polished rice, sake cake, and sake was 29.9, 25.3, 154.7 μg/kg and 1.29 μg/l, respectively. When the Cd content of brown rice was represented as 100, the relative content of the polished rice was 78 (average of 7 samples). These results showed that the Cd content was reduced slightly by the polishing process, and that the Cd in rice had hardly shifted to the sake, but shifted easily to the sake cake.
【日本醸造学会誌、104、209-214、(2009)】
Ethanol stress stimulates the Ca2+-mediated calcineurin/Crz1 pathway in Saccharomyces cerevisiae
(エタノールストレスは、Saccharomyces cerevisiaeにおいてカルシウムイオンを介してカルシニューリン/Crz1経路を活性化する)
Yoshio Araki, Hong Wu, Hiroshi Kitagaki, Takeshi Akao, Hiroshi Takagi and Hitoshi Shimoi
(荒木義雄、呉洪、北垣浩志、赤尾健、高木博史、下飯仁)
 Environmental stimuli elicit a stress response, which helps to maintain cell survival. In budding yeast Saccharomyces cerevisiae, environmental cues can activate calcineurin, a highly conserved Ca2+- and calmodulin-dependent protein phosphatase. Calcineurin dephosphorylates the transcription factor Crz1, leading to accumulation of Crz1 in the nuclei and expression of stress responsive genes under the control of a calcineurin-dependent response element (CDRE). Ethanol is the final product of sugar fermentation by yeast, and thus a frequently encountered yeast stressor. However, adaptation of yeast to ethanol stress is poorly understood. In this study, we show that ethanol stimulates calcineurin-dependent nuclear localization of Crz1 and CDRE-dependent gene expression. Moreover, cells in which CRZ1 is deleted exhibit defective adaptation to ethanol stress, while a multicopy plasmid of CRZ1 confers an increased level of adaptive stress tolerance to ethanol. Taken together, the results indicate that ethanol activates the calcineurin/Crz1 pathway and that CRZ1 is crucial for cell survival under ethanol-induced stress.
(和文要旨)
 環境からの刺激は、細胞の生存性を高める「ストレス応答」を誘引する。出芽酵母では、環境刺激がカルシウムイオン・カルモジュリン依存型タンパク質フォスファターゼに依存したカルシニューリン・シグナル伝達経路を活性化する。カルシニューリンは転写調節因子Crz1タンパク質を脱リン酸化し、Crz1タンパク質の核への蓄積をひきおこすとともに、CDRE(calcineurin-dependent response element)配列制御下のストレス応答遺伝子群の発現を誘導する。エタノールは糖を炭素源とした発酵の最終産物であるので、酵母はしばしばエタノールによるストレスにさらされる運命にある。しかしながら、酵母がエタノールストレスにどのように適応しているのか、これまで詳しく解析されてこなかった。本研究では、エタノールがカルシニューリン依存的にCrz1タンパク質の核局在とCDRE依存的な遺伝子発現を促進することを報告する。加えて、crz1遺伝子破壊酵母細胞群はエタノールへの適応ストレス応答に欠損を示す一方で、多コピープラスミドを持つ酵母細胞群は適応ストレス応答への耐性を獲得した。以上の結果は、エタノールはカルシニューリン/Crz1経路を活性化し、この活性化はエタノールによるストレスを受けた細胞の生存に非常に重要であることを示すものである。
J. Biosci. Bioeng., 107, 1-6 (2009)】
Development of VNTR markers for three Aspergillus species used in brewing
(醸造関連Aspergillus3種の識別に有益な単純繰り返し配列マーカーの開発)
Kenta TOMIMURA, Kazuhiro IWASHITA, Osamu YAMADA, Ken KOBAYASHI
(冨村健太、岩下和裕、山田修、小林健)
 Using a bioinformatics approach, we developed 18 variable number of tandem repeat markers for Aspergillus ozyzae for use in population genetic studies. Repeat sequences in the genome sequences of A. ozyzae were identified by a tandem repeat finding program. Length polymorphisms at 18 loci were examined in 41 strains of A. ozyzae. The total number of alleles per locus ranged from two to 20. Investigation of cross-species amplifications with A. sojae and A. tamarii showed success. The variable number of tandem repeat markers will be used to determine the population structure of these three Aspergillus species used in brewing.
(和文要旨)
 バイオインフォマティック手法を用いて、Aspergillus ozyzae, A. sojaeおよびA. tamariiの集団遺伝学的解析に有益な18種類の単純繰り返し配列マーカーを開発した。A. Ozyzae のゲノム配列中に見られる繰り返し配列はタンデムリピート検索プログラムを用いて検索した。18遺伝子座での長さの多型は41系統のA. ozyzae 、5系統の A. sojaeおよび2系統のA. tamariiを含む合計48系統について調査した。遺伝子座あたりの対立遺伝子数は2から20であった。これら単純繰り返し配列マーカーは、醸造関連Aspergillus種の集団遺伝構造を決定するのに用いられるであろう。
Molecular Ecology Resources、9、613-615、(2009)】
Treatment and phosphorus removal from high-concentration organic wastewater by the yeast Hansenula anomala J224 PAWA.
(酵母Hansenula anomala J224 PAWAによる高濃度有機排水からのリン除去及び処理)
Watanabe T, Masaki K, Iwashita K, Fujii T, Iefuji H.
(渡部貴志、正木和夫、岩下和裕、藤井力、家藤治幸)
 A flocculent yeast, Hansenula anomala J224 PAWA, bred in this study, accumulated twice as much phosphorus as the wild type. Over a 30-d period, PAWA removed 70-80% of dissolved total phosphorus from sweet-potato and barley shochu wastewaters (alcoholic distillery wastewaters) while the wild type removed only 30%. Waste sludge was easily separated from effluent wastewater because PAWA cells made large flocks that rapidly settled. Component analysis suggested that PAWA sludge could be used as a protein source for feedstuff and as a phosphorus source for fertilizer. Under anaerobic conditions, denitrification was rapid, resulting in the removal of large amounts of nitrogen from barley shochu wastewater. These results suggest that small shochu manufacturers could benefit from using PAWA to remove phosphorus and organic compounds and then by using a combination of the upflow anaerobic sludge blanket and the downflow hanging sponge method (UASB-DHS method) for nitrification/denitrification.
(和文要旨)
 本研究で育種した凝集酵母Hansenula anomala J224 PAWAは、野生株に比べて2倍のリンを蓄積した。30日を超える期間、PAWAは、野生株では30%しか除去できない甘藷焼酎排液や麦焼酎排液(アルコール蒸留排液)の溶解性の全リンを70〜80%を除去した。PAWA細胞は素早く沈降し大きな凝集塊をつくるので、余剰汚泥は流出排水から簡単に分離することができた。成分分析の結果を見ると、PAWAの余剰汚泥は、飼料のためのタンパク源や肥料のためのリン源として使用可能であることが示唆された。嫌気条件での脱窒作用は急速で、麦焼酎排水から多量の窒素が除去された。これらの結果はリンや有機成分を除去するのにPAWAを使用し、硝化/脱窒作用にUASB-DHS法(UASB法と下降流スポンジ担体法の組み合わせ)を使用することが、小規模焼酎製造場の利益になるであろうことを示唆している。
Bioresour Technol. 100, 1781-1785, (2009)】
ONIOM Study of the Mechanism of the Enzymatic Hydrolysis of Biodegradable
Plastics
(生分解性プラスチックの酵素分解メカニズムのONIOM 法による研究)
Yoshitake Sakae, Toshiaki Matsubara, Misako Aida, Hidemasa Kondo, Kazuo Masaki and Haruyuki Iefuji
(榮慶丈,松原世明,相田美砂子,近藤英昌,正木和夫,家藤治幸)
 A cutinase-like enzyme (CLE), which is purified experimentally from the yeast Cryptococcus sp. strain S-2, has been recently found to degrade biodegradable plastics very efficiently. In this study, we theoretically examine the mechanism of hydrolysis of biodegradable plastics by the CLE by means of the ONIOM method. We optimize all the intermediates and the transition states involved in the considered enzymatic reaction and determine the energy surface of the entire catalytic cycle. The calculations show that the amino acid residues inside the pocket of the active site, Thr17 and Gln86, which stabilize the tetrahedral intermediates, and Gly115 in addition to Ser85, His180, and Asp165, which compose the catalytic triad, significantly contribute to the catalytic reaction. This is similar to the case of serine protease reported to date. Moreover, we have newly found that the energy barrier of the catalytic cycle is significantly lowered
by the electronic effect of the OH group in the side-chain of Thr17 and bound water. The calculated potential energy surface of the reaction shows that the cleavage of the ester bond is a rate-determining step.
(和文要旨)
 廃水処理用酵母Cryptococcus sp. S-2 によって分泌生産される酵素Cutinase-like enzyme(CLE)は,各種生分解性プラスチックに対してこれまで知られていた分解酵素よりも高い分解能力をもつことが知られている。本研究では計算化学的手法の一つであるONIOM 法を用いることによって,酵素CLE の触媒反応過程について解析を行った。その結果,これまでに知られているセリンプロテアーゼと同様の働きを持つとされるアミノ酸Ser85,His180,Asp165,Thr17,Gln86,Gly115 が見つかった。
さらに酵素CLE はThr17 の側鎖のヒドロキシ基(OH グループ)と結合水があることにより,より安定して触媒反応が進むことが分かった。
Bulletin of the Chemical Society of Japan, 82, 338-346, (2009)】
Characterization of an -L-rhamnosidase from Aspergillus kawachii and its gene
(アスペルギルス カワチのα-L-ラムノシダーゼの性質とその遺伝子)
Koseki T, Mese Y, Nishibori N, Masaki K, Fujii T, Handa T, Yamane Y, Shiono Y, Murayama T, Iefuji H.
(小関卓也、目瀬友一朗、西堀奈穂子、正木和夫、藤井力、半田尚、山根雄一、塩野義人、村山哲也、家藤治幸)
 An -L-rhamnosidase was purified by fractionating a culture filtrate of Aspergillus kawachii grown on L-rhamnose as the sole carbon source. The α-l-rhamnosidase had a molecular mass of 90 kDa and a high degree of N-glycosylation of approximately 22%. The enzyme exhibited optimal activity at pH 4.0 and temperature of 50 ℃. Further, it was observed to be thermostable, and it retained more than 80% of its original activity following incubation at 60 ℃ for 1 h. Its T 50 value was determined to be 72 ℃. The enzyme was able to hydrolyze -1,2- and -1,6-glycosidic bonds. The specific activity of the enzyme was higher toward naringin than toward hesperidin. The A. kawachii -L-rhamnosidase-encoding gene (Ak-rhaA) codes for a 655-amino-acid protein. Based on the amino acid sequence deduced from the cDNA, the protein possessed 13 potential N-glycosylation recognition sites and exhibited a high degree of sequence identity (up to 75%) with the -L-rhamnosidases belonging to the glycoside hydrolase family 78 from Aspergillus aculeatus and with hypothetical Aspergillus oryzae and Aspergillus fumigatus proteins.
(和文要旨)
 L-rhamnoseを唯一の炭素源として培養したAspergillus kawachiiの培養ろ液から -L-rhamnosidaseを精製した。取得した -L-rhamnosidaseの分子量は90kDaで、約22%と高度にN-糖鎖化されていた。酵素はpH4.0、温度50℃が至適であった。さらに、60℃1時間処理しても活性の80%を保持しており、耐熱性が見られた。酵素は、 -1,2-と -1,6-のグリコシド結合を加水分解し、ナルギニンに対しての方がヘスペリジンに対してよりも比活性が高かった。A. kawachiiの -L-rhamnosidase遺伝子(Ak-rhaA)は655アミノ酸をコードしていた。cDNAから推測されるアミノ酸配列から、タンパクは、13箇所のN-結合糖鎖付加認識部位を持ち、Aspergillus aculeatusのglycoside hydrolase family 78に属する -L-rhamnosidasesやAspergillus oryzaeAspergillus fumigatusのゲノム解析から予測されたタンパクと最大75%にもなる高い相同性を示すことが分かった。
Appl Microbiol Biotechnol. 80, 1007-1013, (2008)】

Screening and Identification of Precursor Compounds of Dimethyltrisulfide (DMTS) in Japanese Sake
(清酒中のジメチルトリスルフィド(DMTS)前駆物質の探索および同定)

Atsuko Isogai, Ryoko Kanda, Yoshikazu Hiraga, Toshihide Nishimura, Hiroshi Iwata, and Nami Goto-Yamamoto
(磯谷敦子、神田涼子、平賀良知、西村敏英、岩田博、後藤(山本)奈美)

 Dimethyltrisulfide (DMTS) is involved in the unpalatable aroma of stale sake, called “hineka”; however, the mechanism underlying the formation of DMTS during the storage of sake has not been elucidated. Here we investigated the precursors of DMTS in sake. An experiment using [methyl-d3]-methionine showed that Strecker degradation of methionine plays a minor role in the formation of DMTS. Separation of components in sake by cation exchange resin revealed that DMTS precursors are present in the acidic/neutral fraction rather than in the basic one. Purification of the DMTS precursor compounds was carried out through several chromatographic steps, measuring DMTS producing potential as an index. High-resolution ESI-MS and 1-D/2-D NMR experiments enabled to identify one of the precursor compounds as 1,2-dihydroxy-5-(methylsulfinyl)pentan-3-one.
(和文要旨)
 ジメチルトリスルフィド(DMTS)は「老香」とよばれる清酒の劣化臭に寄与する香気成分であるが、清酒貯蔵中における生成機構は明らかとなっていない。そこで我々は清酒中のDMTS前駆物質の探索を行った。[methyl-d3]-メチオニンを用いた実験から、DMTS生成に対するメチオニンのストレッカー分解の寄与は小さいことが示された。清酒成分を陽イオン交換樹脂で分画した結果、DMTS前駆物質は主に酸性/中性画分に含まれることが明らかとなった。DMTS生成ポテンシャルを指標として数種類のクロマトグラフィーによりDMTS前駆物質を精製し、HR-ESI-MSおよび1-D/2-D NMR分析を行った結果、前駆物質は1,2-dihydroxy-5-(methylsulfinyl)pentan-3-oneと同定された。
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 189-195 (2009)】

(2)公 開 特 許

出願番号  :特許出願2008-154998(P2008-154998)
出願日   :2008年6月13日
公開番号  :特許公開2009-17877(P2009-17877A)
公開日   :2009年1月29日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :橋口 知一、後藤 邦康
発明の名称 :酒類の製造方法
【課題】
シアン配糖体を含む果実(梅、杏、桃、ビワ、プラム、チェリー等)を原料とする酒類(梅酒リキュール等)中のカルバミン酸エチルを低減する製造方法、及び、かかる製造方法によって製造してなる新規な酒類を提供することにある。
【解決手段】
シアン配糖体を含む果実を原料とし、その製造工程を低酸素条件下で行うことにより(液体中の溶存酸素濃度を低下させる方法、例えばインラインミキサーの使用; 製造装置や容器の空間部の酸素を低減させる方法、例えば脱酸素剤の使用)カルバミン酸エチルを低減した酒類を簡便な操作で製造する。また、さらに、低酸素条件を6ヶ月以上としたりする方法; 加熱処理、例えば40℃以上の加熱処理; ペントース処理; 酸素接触処理のすくなくともひとつの処理により、着色度を高めることもできる。また、放置処理の併用も有効である。
出願番号  :特許出願2007-228843(P2007-228843)
出願日   :2007年9月4日
公開番号  :特許公開2009-60797(P2009-60797A)
公開日   :2009年3月26日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :正木 和夫、池田 博子、藤井 力、家藤 治幸
発明の名称 :異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法
【課題】
異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法を新たに開発することを課題とする。
【解決手段】
液胞輸送異常変異株の中から、VPS(vacuolar protein sorting)関連遺伝子欠損(破壊)株であって、親株よりも異種タンパクの分泌生産量の高い株(例えば、vps3、vps28、vps32、vps45、vps66欠損株)を選抜することにより、異種タンパク質分泌高生産株を選抜する。選抜された株は、異種タンパク質を高分泌発現する宿主微生物として利用することができる。
出願番号  :特許出願2007-229085(P2007-229085)
出願日   :2007年9月4日
公開番号  :特許公開2009-60804(P2009-60804A)
公開日   :2009年3月26日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :和田 純平、池田 博子、正木 和夫、藤井 力、家藤 治幸
発明の名称 :ピヒア属酵母において異種タンパク質を高分泌させる方法
【課題】
異種タンパク質を微生物(特にピヒア属酵母)で培地中に高分泌生産させるために必要な分泌シグナル配列を新規に開発することを課題とするものである。
【解決手段】
アスペルギルス・オリーゼ(Aspergillus oryzae)由来タカ(Taka)アミラーゼシグナル配列(TAAシグナル配列)を使用する。このTAAシグナル配列の下流に目的とする異種タンパク質遺伝子を配した組換え分泌プラスミドをピヒア・パストリス(Pichia pastoris)に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、目的タンパク質を培地中に高分泌させることができる。
出願番号  :特許出願2007-229486(P2007-229486)
出願日   :2007年9月4日
公開番号  :特許公開2009-61367(P2009-61367A)
公開日   :2009年3月26日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :田中 未来、渡部 貴志、岡田 真実、正木 和夫、藤井 力、家藤 治幸
発明の名称 :糖蜜色素を脱色する微生物とそれを利用する脱色処理方法
【課題】
難脱色性色素を含有する有色廃液の生物的脱色処理方法を開発することを目的とする。
【解決手段】
広島市内の河川から新たに分離したペニシリウム属糸状菌(Penicillium oxalicum)を用いて有色廃液を処理することにより、目的が達成される。有色廃液としては、廃糖蜜、廃糖蜜発酵蒸留廃液、黒糖焼酎粕のほか、ポリフェノール系色素やメラノイジン系色素含有廃液が例示される。これらの微生物は、有色廃液を効率的に脱色するが、その脱色は一時的なものではなく、長期間継続し、培養時間の過程によって着色が戻ってくることもないという著効が奏される。
出願番号  :特許出願2007-230092(P2007-230092)
出願日   :2007年9月5日
公開番号  :特許公開2009-60819(P2009-60819A)
公開日   :2009年3月26日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :冨村 健太、岩下 和裕、山田 修、小林 健
発明の名称 :アスペルギルス属菌の菌株識別方法及びそのためのプライマーセット
【課題】
麹菌(アスペルギルス・オリゼ)のような醸造関連麹菌株をはじめとするアスペルギルス属菌の菌株を従来法よりも詳細に識別できる手段を提供すること。
【解決手段】
アスペルギルス属菌のゲノムDNA中に存在する特定の単純繰り返し配列のうちの少なくとも1種における繰り返し配列長多型を指標として菌株を識別することを含む、アスペルギルス属菌の菌株識別方法、及びそのためのプライマーセットを提供した。
2009/4/8 掲載

2.第3四半期研究成果情報について

(1)研究成果

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
Brewing characteristics of haploid strains isolated from the sake yeast Kyokai no. 7
(清酒酵母きょうかい7号から分離した一倍体の醸造特性について)
Taku Katou, Hiroshi Kitagaki, Takeshi Akao and Hitoshi Shimoi
(加藤拓、北垣浩志、赤尾健、下飯仁)
 Sake yeast exhibit various characteristics that make them more suitable for sake brewing compared to other yeast strains. Since sake yeast strains are Saccharomyces cerevisiae heterothallic diploid strains, it is likely that they have heterozygous alleles on homologous chromosomes (heterozygosity) due to spontaneous mutations. If this is the case, segregation of phenotypic traits in haploid strains after sporulation and concomitant meiosis of sake yeast strains would be expected to occur. To examine this hypothesis, we isolated 100 haploid strains from Kyokai no. 7 (K7), a typical sake yeast strain in Japan, and compared their brewing characteristics in small scale sake brewing tests. Analyses of the resultant sake samples showed a smooth and continuous distribution of analytical values for brewing characteristics, suggesting that K7 has multiple heterozygosities that affect brewing characteristics and that these heterozygous alleles do segregate after sporulation. Correlation and principal component analyses suggested that the analytical parameters could be classified into two groups indicating fermentation ability and the taste of sake.
(和文要旨)
清酒酵母は他の酵母と比較して酒造りにより適した様々な特性を示す。清酒酵母はSaccharomyces cerevisiaeに属するヘテロタリックな二倍体であるので、相同染色体に関して自然変異によりヘテロザイガスなアレルを持つと考えられる。この場合、胞子形成に伴う減数分裂を経た一倍体において表現形質の分離が起こることが期待される。この仮説を調べるために、我々は日本で代表的な清酒酵母であるきょうかい7号(K7)から100株の一倍体を分離し小仕込試験により醸造特性を比較した。小仕込後の清酒サンプルの分析から醸造特性に関して調べた分析値は滑らかな連続した分布を示し、K7は醸造特性に影響を与える複数のヘテロザイゴーシティを持ち、これらへテロザイガスなアレルは胞子形成後に分離することが示唆された。相関及び主成分分析は分析パラメーターが発酵力と清酒の味との2つのグループに分類することができることを示唆した。
Yeast, 25, 799-807 (2008)】
Bunch Shading During Different Developmental Stages Affects the Phenolic Biosynthesis in Berry Skins of 'Cabernet Sauvignon' Grapes
(異なる時期の果房の遮光がカベルネソーヴィニヨンブドウ果皮におけるフェノール化合物生成へ及ぼす影響)
Kazuya KOYAMA, Nami GOTO
(小山和哉、後藤奈美)
 The effect of bunch shading during early development (before the onset of ripening) and/or during ripening on the phenolic composition of grape skins (Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon) as well as on the mRNA levels of the biosynthetic genes on the flavonoid pathway was examined. Shading during early development resulted in decreased proanthocyanidin (PA) concentrations. The PA concentrations decreased during ripening, and the decrease of the concentrations was lower in berries shaded during early development than that in the exposed berries. Thus, no significant effect of shading during early development was observed at harvest. Shading during ripening did not influence this decline in the PAs. On the other hand, shading during early development induced changes in the composition such as a decrease of the trihydroxylated subunits within PAs, which agreed with the relative decrease of VvF3'5'H expression. The anthocyanin concentrations were remarkably reduced when the bunches were shaded during ripening, which was in accordance with the decreased transcription of several anthocyanin biosynthetic genes and transcriptional factors. Shading during early development did not influence the anthocyanin concentrations at harvest; however, it decreased the proportion of trihydroxylated anthocyanins. Thus, shading during early development also had an influence on the compounds biosynthesized during ripening.
(和文要旨)
 果実発育初期(ベレーゾン期以前)及び/又は成熟期の果房の遮光がカベルネソーヴィニヨン果皮におけるフェノール化合物組成及びフラボノイド生合成系遺伝子のmRNAレベルへ及ぼす影響について検討した。果実の発達初期では遮光はプロアントシアニジン(縮合型タンニン)(PA)の濃度を減少させた。PA濃度は成熟期に減少したが、その減少率は発育初期に遮光した果房においてよりゆるやかであった。その結果、発達初期の遮光は収穫期のPA濃度には影響を及ぼさなかった。また、成熟期の遮光はPA濃度の減少に影響を及ぼさなかった。一方、発育初期の遮光はPAの組成の変化を誘導した。すなわち、PAの構成成分における3'4'5'-OH(フラボノイドB環の水酸基数が3つついたユニット)の割合の減少がみられ、これはVvF3'5'Hの発現の相対的な減少と矛盾しない結果であった。アントシアニン濃度は成熟期の遮光によって顕著に抑制されたが、これはアントシアニン生合成系の遺伝子及びその転写因子の発現の減少と矛盾しない結果であった。一方で、発育初期の遮光は収穫期におけるアントシアニン濃度に影響を及ぼさなかったが、組成における3'4'5'-OHアントシアニンの割合を減少させた。従って、発育初期の遮光は成熟期に生合成される物質に対しても持続的な影響をもたらすことがわかった。
Journal of the American Society for Horticultural Science、133(6)、743-753、(2008)】
Expression analysis of UDP-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase (UFGT) gene in an interspecific hybrid grape between Vitis ficifolia var. ganebu and Vitis vinifera cv. Muscat of Alexandria
Vitis ficifolia var. ganebuVitis vinifera cv. muscat of Alexandria種間雑種でのUDP-グルコース:フラボノイド 3-O-グルコシルトランスフェラーゼ(UFGT)遺伝子の発現)
Puspa Raj POUDEL, Nami GOTO-YAMAMOTO, Ryosuke MOCHIOKA, Ikuo KATAOKA, Kenji BEPPU
(プスパ・ラジャ・ポウデル、後藤(山本)奈美、望岡亮介、片岡郁雄、別府賢治)
 Kadainou R-1, an interspecific hybrid grape derived from red (Vitis ficifolia var. ganebu) and white (V. vinifera cv. Muscat of Alexandria) grapes, accumulates high concentrations of anthocyanin in the berry skin. Hence, the expression of uridine 5'-diphosphate (UDP)-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase (UFGT), the
key enzyme of the anthocyanin pathway, was examined in the berry skin of Kadainou R-1. As information on gene sequences of V. ficifolia var. ganebu and other wild grape
species was unavailable, we performed GeneChip hybridization using biotin-labeled genomic deoxyribonucleic acid (DNA) to investigate how the genomic sequences of V. vinifera varieties and that of V. ficifolia var. ganebu differ. The study showed a lower correlation coefficient between V. vinifera cultivars and V. ficifolia var. ganebu than that among V. vinifera cultivars. The sequences of the UFGT gene derived from both parents of the red and white cultivars were sequenced in Kadainou R1 and revealed that both were expressed irrespective of the fact that it was not expressed in the white grape (male parent).
(和文要旨)
 香大農R-1は、赤(リュウキュウガネブ)と白(マスカット・オブ・アレキサンドリア)のブドウの種間雑種で、果皮に高濃度のアントシアニンを蓄積する。そこで、アントシアニン合成系のキーエンザイムであるUFGTの、香大農R-1果皮での発現を検討した。リュウキュウガネブなどの野生ブドウの遺伝子配列情報は得られていないため、ビオチンラベルしたゲノムDNAを用いたジーンチップのハイブリダイゼーションを行い、V. vinifera栽培品種とリュウキュウガネブのゲノムシーケンスがどの程度異なるかを検討した。その結果、ハイブリダイゼーション強度の相関係数は、V. vinifera栽培品種間よりV. vinifera栽培品種とリュウキュウガネブ間の方が低い値を示した。両親株に由来するUFGTの配列を香大農R-1から得て、発現解析をしたところ、親では発現していない白ブドウ由来のUFGTも香大農R-1で発現していることが明らかになった。
Plant Biotechnol Rep 2, 233-238, (2008)】
気温と清酒の粕歩合について
(Relationship between sake cake ratios and atmospheric temperature conditions)
橋爪克己、奥田将生
(Katsumi HASHIZUME, Masaki OKUDA)
 清酒粕歩合の全国平均値と日本の21観測地点の月別平均気温との間の相関係数は9月に正のピークを示したが、冬期には明確な傾向を示さなかった。この結果は、原料米の登熟期間中の気温条件が清酒醪中の蒸米の消化性に強く影響を及ぼしていることを示唆している。一方、冬期の気温条件の影響は明確に観察されなかった。
(英文要旨)
 Correlation coefficients between the national mean data of sake cake ratios and mean data of monthly atmospheric temperatures of 21 meteorological observation points in Japan showed positive peaks in September, but did not show clear tendencies in winter. The results obtained suggest that atmospheric temperature conditions during the grain-filling period of material rice strongly affect the digestibility of steamed rice grains in sake mash. On the other hand, the effect of atmospheric temperature conditions during winter was not clearly observed.
【日本醸造学会誌、103、945-948、(2008)】

(2)公 開 特 許

出願番号  :特許出願2007-157321(P2007-157321)
出願日   :2007年6月14日
公開番号  :特許公開2008-306973(P2008-306973A)
公開日   :2008年12月25日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :橋口 知一、後藤 邦康
発明の名称 :酒類の製造方法
【課題】
シアン配糖体を含む果実(梅、杏、桃、ビワ、プラム、チェリー等)を原料とする酒類(梅酒リキュール等)中のカルバミン酸エチルを低減する製造方法、及び、かかる製造方法によって製造してなる新規な酒類を提供することにある。
【解決手段】
シアン配糖体を含む果実を加熱処理し(湯煎、蒸きょう、熱風乾燥、電子レンジ処理等)、これを原料として、常法にしたがい(糖分を含んでも良いアルコール液に浸漬して必要成分を浸出させ)、カルバミン酸エチルを低減した酒類を簡便な操作で製造する。
出願番号  :特許出願2007-157410(P2007-157410)
出願日   :2007年6月14日
公開番号  :特許公開2008-306975(P2008-306975A)
公開日   :2008年12月25日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :橋口 知一、後藤 邦康
発明の名称 :酒類の製造方法
【課題】
シアン配糖体を含む果実(梅、杏、桃、ビワ、プラム、チェリー等)を原料とする酒類(梅酒リキュール等)中のカルバミン酸エチルを低減する製造方法、及び、かかる製造方法によって製造してなる新規な酒類を提供することにある。
【解決手段】
シアン配糖体を含む果実を原料とし、その製造工程中に原料であるシアン配糖体を含む果実以外の酸化防止効果のある物質(例えば、亜硫酸ガス、亜硫酸塩、ポリフェノール、アスコルビン酸、柿渋、酸化防止剤を含んだ又は含まないワイン、ビール、果汁等)を添加することにより、カルバミン酸エチルを低減した酒類を簡便な操作で製造する。
2008/12/25 掲載

3.第2四半期研究成果情報について

(1)研究成果

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
マウスの慢性アルコール性肝障害モデルにおける清酒濃縮物、α-エチルグルコシド投与の影響
(Effect of a Concentrate of Sake and Ethyl α-D-glucoside on Chronic Alcohol-induced Liver Injury in Mice)
伊豆英恵、樋詰和久、後藤邦康、広常正人
(Hanae IZU, Kazuhisa HIZUME, Kuniyasu GOTO, Masato HIROTSUNE)
 我々はマウスの慢性アルコール性肝障害モデルを用い、血漿のGPT活性、血漿・肝臓のTG値を測定して清酒濃縮物(CS)及び清酒特異的な糖の1つであるα-エチルグルコシド(α-EG)の肝保護作用を調べた。雄性C57/BL6マウスにLiber-Decalliのアルコール飼料またはコントロール飼料を4週間投与し、この間、CS(3 ml/kg体重)またはα-EG(200 mg/kg体重)を週5回、経口投与した。この結果、アルコール摂取で誘導される血漿GPT活性及び血漿・肝臓TG値の上昇がCSまたはα-EGによって抑制されており、CSとα-EGが慢性アルコール性肝障害を抑制することが示唆された。以上より、清酒にアルコールによる肝障害を軽減する成分が含まれることが推定される。
(英文要旨)
 We investigated the hepatoprotective effects of a concentrate of sake (CS) and a sake-specific sugar, ethyl α-D-glucoside (α-EG), against chronic alcohol-induced liver injury by measuring the plasma pyruvate transaminase (GPT) activity and the plasma and liver tryacylglycerol (TG) levels in mice. Male C57/BL6 mice were orally administered with CS (3 ml/kg) or α-EG (200 mg/kg) 5 times per week while on a Lieber-DeCarli diet with or without ethanol for 4 weeks. In the mice ingesting CS orα-EG, the alcohol-induced increase in plasma GPT activity and increases in plasma and liver TG levels were suppressed, suggesting that CS and α-EG suppress chronic alcohol-induced liver injury in mice. We showed that sake has components attenuating alcoholic liver injury.
【日本醸造学会誌、103、646-652、(2008)】
Expression of multi-copy flavonoid pathway genes coincides with anthocyanin, flavonol and flavan-3-ol accumulation of grapevine
(ブドウのアントシアニン、フラボノ―ル及びフラバン-3-オルの蓄積と同調するマルチコピーフラボノイド合成系遺伝子の発現)
S.T. Jeong, N. Goto-Yamamoto, K. Hashizume, M. Esaka
(鄭硯泰、後藤(山本)奈美、橋爪克己、江坂宗春)
 The biosynthetic pathways of main grape flavonoids: anthocyanins, flavonols, and flavan-3-ols, hold in common the early step enzymes of biosynthetic pathway: chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), and flavanone 3-hydroxylase (F3H), the genes of which are multi-copied in the grape genome. The ratios of mRNA levels of the three Chss (Chs1, Chs2, and Chs3), as well as those of the two Chis (Chi1 and Chi2) and those of the two F3hs (F3h1 and F3h2), were different among organs, even though no organ-specificity was observed in the strictest sense. Multiple regression analysis demonstrated that the transcription of particular genes significantly coincided with the biosynthesis of a particular flavonoid: the transcription of Chi2 coincided with flavan-3-ol; Chs1, Chs2, F3h1 and F3h2 with flavonol; and Chs2, Chs3, and F3h2 with anthocyanin biosynthesis. Thus, the transcription of these multi-copy genes is likely induced differently for the biosyntheses of anthocyanins, flavonols, and flavan-3-ols.
(和文要旨)
 ブドウの主要なフラボノイド(アントシアニン、フラボノール、フラバン-3-オル)は、生合成系の初期段階の酵素であるカルコンシンターゼ(CHS)、カルコンイソメラーゼ(CHI)、フラバノン3-ヒドロキシラーゼ(F3H)を共有しており、これらの酵素はブドウゲノム中にマルチコピーで存在する。3つのChs (Chs1, Chs2, Chs3)、2つのChi (Chi1, Chi2)、2つのF3h (F3h1, F3h2) のmRNAレベルは器官によって異なっていたが、厳密な意味での器官特性は見いだせなかった。一方、重回帰分析によって、特定のフラボノイドの生合成に特定の遺伝子の発現が強く同調していること、すなわち、Chi2の発現はフラバン-3-オルの生合成に、Chs1, Chs2, F3h1及びF3h2はフラボノール生合成に、Chs2, Chs3, 及びF3h2はアントシアニン生合成に同調していることが示された。従って、これらのマルチコピー遺伝子は、アントシアニン、フラボノール、フラバン-3-オルの生合成によって異なる発現誘導を受けていると考えられた。
Vitis、47、135-140、(2008)】
Breeding of wastewater treatment yeasts that accumulate high concentrations of phosphorus
(リン酸高取込排水処理用酵母の育種)
Watanabe T, Ozaki N, Iwashita K, Fujii T, Iefuji H.
(渡部貴志、尾崎則篤、岩下和裕、藤井力、家藤治幸)
 Inorganic phosphate is an essential nutrient. In general, microorganisms take up phosphorus when the extracellular phosphorus concentration is low, but not when it is high. In Saccharomyces cerevisiae, the major phosphate transporters, such as Pho84p, and acid phosphatases (APases), such as Pho5p, are regulated in parallel by the phosphate signal transduction pathway (PHO pathway). We found that PHO mutants expressing PHO84 and PHO5, even under high-P conditions, could take up phosphorus at twice the rate of the wild-type strain. The regulatory pathway for phosphorus accumulation in two wastewater treatment yeasts, Hansenula fabianii J640 and Hansenula anomala J224-1, was found to be similar to that in S. cerevisiae. We screened for mutants of these yeasts that constitutively expressed APase. Such mutants formed blue colonies on high phosphorus concentration agar plates containing 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (X-phosphate). We found four mutants of H. fabianii J640 and one mutant of H. anomala J224-1 that accumulated from 2.2 to 3.5 times more phosphorus than the parent strains. The growth rates and abilities to remove dissolved total nitrogen and dissolved organic carbon of the mutants were similar to those of the parent strains. In addition, the mutants removed 95% of dissolved total phosphorus from shochu wastewater, while the parent strain removed only 50%.
(和文要旨)
 無機リン酸は必須栄養素である。一般的に、微生物は、外界のリン濃度が低いとリンを取り込むが、高いと取り込まない。Saccharomyces cerevisiaeでは、Pho84pといった主要なリン取込酵素やPho5pといった酸性フォスファターゼ(APase)は、リン酸シグナルトランスダクション経路(PHO経路)により並行して制御されている。我々は、PHO84PHO5を発現しているPHO経路の変異株が外界のリン濃度が高くとも、野生株の2倍の速さで取り込むことを発見した。排水処理酵母Hansenula fabianii J640株とHansenula anomala J224-1株のリン蓄積制御機構がS. cerevisiaeのものと似ていることを見つけ、APaseを恒常的に発現するこれらの酵母の変異株をスクリーニングした。これらの変異株は、5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (X-リン酸)を含む高リン酸含有寒天培地で青いコロニーを形成した。我々は、H. fabianii J640株から4株、H. anomala J224-1株から1株、親株より2.2倍から3.5倍リンを蓄積する変異株を見つけた。変異株の増殖速度や全窒素・溶存態有機炭素の除去能力は親株と変わらなかった。さらに、親株では50%しか除去できない焼酎廃液から95%の溶存態の全リンを除去した。
Appl Microbiol Biotechnol. 80,331-8, (2008)】
Removal of triglyceride soil from fabrics by a novel lipase from Cryptococcus sp. S-2
(洗剤製剤の配合物としてのCryptococcus sp. S-2からの新規なリパーゼ : 統計的手法)
K. Thirunavukarasu, N.G. Edwinoliver, S. Durai Anbarasan, M.K. Gowthaman, H. Iefuji、 N.R. Kamini
(ケイ・チルナブカラス、エヌ・ヂィー・エドウィンオリバー、エス・デュライ・アンバルサン、エム・ケイ・ゴーサマン、家藤治幸、エヌ・アール・カミニ)
 Removal of triglyceride molecules from fabrics could be accomplished in laundries using detergents containing lipases. The yeast, Cryptococcus sp. S-2 (CS2) produces a novel lipase, a cutinase-like enzyme that is compatible with various ionic, cationic and non-ionic surfactants as well as commercial detergents and oxidizing agents. In this study, the efficacy of CS2 lipase was assessed for the removal of triglyceride soil, like olive oil from fabrics in a single wash cycle using a tool of response surface methodology (RSM), so as to use the enzyme as an additive in laundry detergent formulations. A five-level four-factorial central composite rotatable design (CCRD) was used to evaluate the interactive effects of detergent concentration, lipase concentration, buffer pH and washing temperature on the percentage removal of triglyceride soil from cotton fabric. The model suggested that all the factors chosen had a significant impact on oil removal and the optimum conditions derived via RSM were 0.5% detergent, 1000 U of lipase, buffer pH of 8.0 and washing temperature of 37.8℃. Under optimal conditions, the removal of olive oil from cotton fabric was 19.6 and 43.1% higher at 20 and 37.8℃, respectively, in the presence of lipase,when
compared to treatment with detergent wash alone. Moreover, the present work will also serve as a baseline of initial studies on cutinases and other related enzymes for its exploitation in laundry
detergents.
(和文要旨)
 布からの油脂物質の除去は、リパーゼを含んだ界面活性剤による洗濯により良好に行うことが出来る。酵母Cryptococcus sp. S-2(CS2)は新規なクチナーゼ様のリパーゼを生産する。本リパーゼは、陽イオン、陰イオン性界面活性剤など様々なイオン性界面活性剤、そして市販の洗剤や酸化剤と相性がよい。本研究では、酵素を洗剤添加剤として使用した時の、CS2リパーゼのオリーブ油により汚した布からの油の除去効率を、response surface methodology (RSM)による解析法で評価した。界面活性剤濃度、リパーゼ濃度、バッファーのpH、そして洗濯温度の綿布からの油汚れの遊離%に与える相互効果は、5水準、4因子の中央複合回転計画central composite rotatable design (CCRD)により評価した。
選ばれた全ての因子は油脂除去に大きな効果を持っており、そしてRSWの解析により得られた最適条件は、0.5%活性剤濃度、1000Uのリパーゼ、pH8.0、洗濯温度37.8℃であった。この条件において、綿布からのオリーブオイルの除去(遊離)は、リパーゼの存在で、20℃、37.8℃で、それぞれ19.6及び43.1%高くなることが示された。
 本研究は、クチナーゼと他の関連酵素を使って洗濯用洗剤を開発することに関する、基準となる初期研究として貢献できるであろう。
Process Biochemistry, 43,701-706(2008)】
平成18酒造年度全国新酒鑑評会出品酒の分析について
(Analysis of Sake Component Presented to the Sake Contest in 2006)
岩田 博、磯谷敦子、中野成美、平松順一
(H. Iwata, A. Isogai, S.Nakano, J. Hiramatsu)
 平成18酒造年度全国新酒鑑評会の出品酒について、酒質の現状及び動向の調査研究のため、調査表の内容を集計するとともに成分分析を行った。審査は平成19年4月24日(火)から26日(木)に予審を、5月9日(水)及び10日(木)に決審を行った。また、5月24日(木)に製造技術者研究会を、6月7日(木)に公開きき酒会を開催した。
酒類総合研究所報告、180, 1-16 (2008)
第45回洋酒・果実酒鑑評会出品種の審査結果及び分析値
(Results of Sensory Evaluation and Analysis of the Western Type Alcoholic beverages Presented to the 45th contest)
三上重明、後藤奈美、小山和哉、平松順一
(S.Mikami, N.Goto, K.Koyama and J.Hiramatsu)
 本鑑評会は、国内洋酒・果実酒メーカーから任意出品された果実酒類、ウイスキー、ブランデー、スピリッツ類及びリキュール類について官能審査、化学分析を行い、品質及び技術の動向を全国的な視野で調査するとともに製造業者の参考に資することを目的として実施している。審査会は、平成19年11月 19、20日の2日間にわたり、酒類総合研究所において開催した。出品酒の官能審査と成分分析の結果の概要について報告した。
酒類総合研究所報告、180, 17-31 (2008)
第30回本格焼酎鑑評会について
(Analysis of Traditional Socchu Presented to the 30th Contest in 2007)
三上重明, 家藤治幸, 向井伸彦, 平松順一
(S. Mikami, H.Iefuji, N.Mukai, J.Hiramatsu)
 第30回本格焼酎鑑評会出品酒の出品酒について官能審査及び成分分析を行った。原料別の出品状況では,米,麦,甘しょ及び酒粕を原料とした製品が増加し,特に甘しょ製品の増加が著しかった。香り,味及び総合評価の評点は,泡盛の特殊製品が良好であった。成分分析については,低沸点香気成分,中高沸点香気成分,チオバルビツル酸価,pH及び酸度などの分析結果について報告した。
酒類総合研究所報告、180, 32-42 (2008)
外因性内分泌かく乱物質と一般微生物の分析
(Analysis of Endocrine Disrupting Chemicals and Microbes in Alcoholic Beverages and Sake Cake)
後藤邦康
(K.Goto)
 平成16年に市販酒類等(清酒,焼酎,ビール,ワイン,ウイスキー,酒粕)について外因性内分泌かく乱物質の分析を行った。そのとき,他の成分に比べて比較的高い数値が見られたノニルフェノール(NP),ビスフェノールA(BPA),フタル酸ジ-2-エチルヘキシル及びアジピン酸ジ-2-エチルヘキシルについて再度調査した結果について述べた。また一般微生物及び大腸菌群の測定を行った。酒類についてNP及びBPAの平均値は,平成16→18→19年度に対して,それぞれ1.9→1.4→1.3μg/l,及び0.55→0.13→0.09μg/lとなった。平成17年度以降,最大となった分析値と各物質の耐容一日許容量から,酒類及び酒粕による影響は大きくないと考えられた。酒類中の微生物は若干増加したが,検出された濃度は最大でも3cfu/mlと低いものであった。全酒類製品で大腸菌群は検出されなかった。
酒類総合研究所報告、180, 43-56 (2008)

酒類に関する国民ニーズ調査
(Investigation of Public Needs on Alcoholic Beverages)

倉光潤一、宇都宮仁、橋爪 克己(Junichi KURAMITSU, Hitoshi UTSUNOMIYA, Katsumi HASHIZUME)

酒類に関する国民のニーズについて4,501名に対し調査を行い(有効回答者数3,294,有効回答率73.2%),前回調査(14年調査)からの変化等について検討した。酒類全般に関する関心分野では,「成分・品質」,「料理との相性」,「種類」が上位を占めた。14年調査と比較すると,男性では全世代で「料理との相性」,40代及び50代以上では「健康」,30代女性では「価格・酒税・格付」に対する関心の割合が増加した。一方、社会生活を営む上で必要な情報では,「飲酒と健康」,「一般知識」,「公共での飲酒マナー」の関心割合が高かった。14年調査と比較すると,「飲酒マナー」,「公共での飲酒マナー」が低下し,「一般知識」「飲酒と健康」及び「新成人への知識」に対する関心が増加した。
酒類総合研究所報告、180、57-72、(2008)
10 清酒・ビール・ウイスキーの飲酒動機に関する調査
(Investigation of consumers motives for their choice of sake, beer, and whisky)
宇都宮仁、橋爪克己
(Hitoshi UTSUNOMIYA, Katsumi HASHIZUME
清酒、ビール、ウイスキーの飲酒回数・量が1年前に比べ増えたという者各約1000人に対して、その飲酒動機等に関する調査を行った。清酒について最も頻度の高かった理由は、官能的要因の「おいしい・うまい」であった。清酒のおいしさは嗜好変化や清酒を飲んでみて知ったことが推定された。ビールについて最も頻度の高かった理由は、「特にない・なんとなく」であった。第2位「仕事・つきあい・会合」、第3位「機会・宴会の増加」と合わせて考えると、つきあいなどの飲酒機会の増加がビールの飲酒回数や量の増加に大きく関与していることが考えられた。ウイスキーについて最も頻度の高かった理由は、官能的要因の「おいしい・うまい」であった。ウイスキーのおいしさは、嗜好変化やウイスキーを飲んでみて知ったことが推定された。
酒類総合研究所報告、180、73-92、(2008)
 

(2)公 開 特 許

出願番号  :特許出願2007-29373(P2007-29373)
出願日   :2007年2月8日
公開番号  :特許公開2008-193904(P2008-193904A)
公開日   :2008年8月28日
出願人   :独立行政法人酒類総合研究所
発明者   :福田 央、三上 重明
発明の名称 :
FLO5遺伝子及びYHR213W又はYAR062W遺伝子を利用した醸造用酵母の判別法
【課題】
醸造用酵母の正確な判別、分離、同定を迅速、正確且つ容易に行う方法の開発。
【解決手段】
醸造用酵母のゲノムDNAをFLO5遺伝子及びYHR213W遺伝子又はYAR062W遺伝子を含むDNA配列の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、PCR法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を電気泳動し、又は制限酵素処理したのち電気泳動し、その電気泳動のパターンの違いにより酵母を判別する。その結果、醸造用酵母の正確な分類・判別が、迅速且つ容易に可能となる。本判別方法は、再現性が高く、しかも極めて短期間に結果を得ることができる。
2008/10/8 掲載

4.第1四半期研究成果情報について

(1)研究成果

項番 研 究 題 目 著   者 要          約
マウスのエタノール経口摂取にともなう酔いの2種類の行動的評価
(Two kinds of behavioral evaluation of intoxication by oral administration of ethanol in mice)
伊豆英恵、後藤邦康、坂田省吾
(Hanae IZU, Kuniyasu GOTO, Shogo SAKATA)
 ヒトを用いた酔いの評価は個人差や倫理的な問題から困難が多い。ヒトではエタノールを飲用するが、動物を用いて行動実験で酔いを評価する場合、一般的にはエタノールを腹腔内投与していた。本研究では摂食あるいは絶食条件下で様々な用量のエタノールをマウスに経口投与して高架式十字迷路試験及び運動量測定を行い、エタノール飲用による酔いの評価系の構築を試みた。高架式十字迷路試験ではエタノールの経口投与(1.6〜4.0 g/kg(単回)、0.8〜1.6 g/kg(2回))によってオープンアームへの進入回数及び滞在時間が増加し、エタノール飲用による抗不安作用が確認された。自発運動量試験では絶食条件下でエタノールの経口投与(1.6または4.0 g/kg(単回)、1.2または2.4 g/kg(2回))によって運動量が有意に減少した。半絶食条件下でエタノールを経口投与(1.6 g/kg(単回))後1時間では運動量が促進されたが、その後、運動量は48時間後まで抑制された。以上の条件を用いてマウスへエタノールを経口投与した場合、高架式十字迷路試験ではエタノールによる運動障害が生じる前の軽度の酔い、自発運動量測定試験では運動量が促進あるいは抑制されるあらゆる段階の酔いを評価可能であることが示唆された。
(英文要旨)
 Evaluation of ethanol intoxication in humans has difficulties in individual differences and ethical considerations. Intraperitoneal injection of ethanol has been used in evaluation of ethanol intoxication in nonhuman animals. We have developed two kinds of behavioral evaluations of intoxication by oral administration of ethanol in mice. Oral administration of ethanol (1.6〜4.0 g/kg as a single dose, 0.8〜1.6 g/kg dosed twice) increased both the number of open-arm entries and the time spent in the open arm of the elevated plus-maze test, demonstrating an anxiolytic-like effect of ethanol. Oral administration of ethanol (1.6 or 4.0 g/kg single dose, 1.2 or 2.4 g/kg dosed twice) significantly decreased locomotor activity under fasting conditions. Under semi-fasting conditions, oral administration of ethanol (1.6 g/kg single dose) transiently enhanced locomotor activity 1 h after administration but decreased subsequently for 48 h. Elevated plus maze and locomotor activity are useful for analyzing mild and mild-to-severe intoxicaton, respectively, caused by oral administration of ethanol on the condition used in this study.
【動物心理学研究、58、1-13、(2008)】
Aspergillus oryzae atfB encodes a transcription factor required for stress tolerance in conidia
(分生子のストレス耐性に必要な転写制御因子をコードする麹菌の遺伝子atfB
Kazutoshi Sakamoto, Toshi-hide Arima, Kazuhiro Iwashita, Osamu Yamada, Katsuya Gomi, Osamu Akita
(坂本和俊、有馬寿英、岩下和裕、山田修、五味勝也、秋田修)
 Using an Aspergillus oryzae EST database, we identified a gene encoding a transcription factor (atfB), which is a member of the ATF/CREB family. Expression of atfB was barely detectable during vegetative growth, but was readily detected during conidiation in solid-state culture. Microarray analyses showed that expression of many other genes, including catalase (catA), were downregulated in an atfB-disruptant. The expression of most of these genes was upregulated in the wild-type strain during the conidiation phase in solid-state culture, and the expression pattern was similar to that of atfB itself. In the absence of stress, e.g. heat shock or hydrogen peroxide, the conidial germination ratios for the ΔatfB strain and the wild-type strain were similar, but the stress tolerance of conidia carrying the ΔatfB deletion was less than that of the wild-type conidia. CRE-like DNA motifs, which are bound by ATF/CREB proteins, were found in the promoters of most of the downregulated genes in the ΔatfB strain. Thus, atfB appears to encode a transcription factor required for stress tolerance in conidia.
(和文要旨)
 麹菌Aspergillus oryzaeのESTデータベースからATF/CREB型転写制御因子をコードする遺伝子atfBを見出した。atfBは分生子形成期である固体培養後期にその遺伝子発現が検出できるが栄養成長時にはほとんど検出できない。マイクロアレイ解析を実施したところ、atfB破壊株ではカタラーゼ遺伝子catAを含む多くの遺伝子の発現が減少していることが確認された。これらの遺伝子の多くは野生株において固体培養後期に遺伝子発現が上昇しており、atfB自身の発現と似ていた。また分生子のストレス耐性を測定したところ、atfB破壊株の分生子は野生株に比べてストレス感受性になっていた。またatfB破壊株で発現が減少する遺伝子のプロモーター領域には、ATF/CREB型転写制御因子が結合するCRE様DNAモチーフが存在していた。以上のことからatfBは分生子のストレス耐性に必要な転写制御因子をコードしていると考えられた。
Fungal Genetics and Biology 45(6), 922-932 (2008)】
Common industrial sake yeast strains have three copies of the AQY1-ARR3 region of chromosome XVI in their genomes
(一般的な清酒酵母は第16番染色体のAQY1-ARR3 領域を3コピー持っている)
Ogihara, Hiroshi Kitagaki, Qian Wang, Hitoshi Shimoi
(荻原深、北垣浩志、王茜、下飯仁)
 Genomic analysis of industrial yeast strains is important for exploitation of their potential. We analysed the genomic structure of the most widely used sake yeast strain, Kyokai no. 7 (K7), by DNA microarray. Since the analysis suggested that the copy number of the AQY1-ARR3 region in the right arm of chromosome XVI was amplified, we performed Southern blot analysis using the AQY1 gene as a probe. The probe hybridized to three bands in the widely used sake strains derived from K7, but only to one band of 1.4 kb in the laboratory strains. Since the extra two bands were not observed in old sake strains, or in other industrial strains, the amplification of this region appeared to be specific for the widely used sake strains. The copy number of the AQY1-ARR3 region appeared to have increased by chromosomal translocation, since chromosomal Southern blot analysis revealed that the AQY1 probe hybridized to chromosomes IV and XIII, in addition to chromosome XVI, in which AQY1 of the laboratory strain is encoded. The chromosomal translocation was also confirmed by PCR analysis using primers that amplify the region containing the breakpoint. Cloning and sequencing of cosmids that encode the AQY1-ARR3 region revealed that this region is flanked by TG1-3 repeats on the centromere-proximal side in chromosomes IV and XIII, suggesting that amplification of this region occurred by homologous recombination through TG1-3 repeats. These results demonstrate the genomic characteristics of the modern widely used sake strains that discriminate them from other strains.
(和文要旨)
 我々は、最も良く使用されている清酒酵母であるきょうかい7号(K7)のゲノム構造をDNAマイクロアレイを用いて解析した。その結果、第16番染色体右腕末端のAQY1-ARR3 領域のコピー数が増加していることが示唆されたので、AQY1遺伝子をプローブとするサザン解析を行った。K6、K7、K9、K10では3コピーのAQY1遺伝子が検出されたが、実験室酵母では1コピーしか検出されなかった。K5以前の清酒酵母や他の産業用酵母でも1コピーしか検出されなかった。染色体サザン及びPCRによる解析の結果、K7などで見られたAQY1-ARR3 領域のコピー数の増加は、第16番染色体右腕の末端が第4番染色体及び第13番染色体の末端に転座した結果生じたことが示唆された。転座の切断点を含む領域をコスミドにクローニングして配列を解析した結果、転座の切断点は第4番染色体及び第13番染色体の末端のTG1-3 リピートに隣接しており、転座がTG1-3 リピートを介しての相同組換えであることが示唆された。以上の結果は、現在の実用清酒酵母が他の酵母菌株とは異なるゲノム構造を持っていることを示している。
Yeast、25、419-432、(2008)】
Preliminary Study for the Development of a Long-Life, Continuous, Primary Fermentation System for Beer Brewing
(ビール醸造の長期連続主発酵システムの開発のための予備検討)
Takashi Inoue and Akihiro Mizuno
(井上 喬、水野 昭博)
 A continuous primary bottom fermentation system for beer brewing with the ability to maintain a stable and high level of yeast activity during its long operation was designed and its performance was evaluated. The basic strategy was to realize the same physiologically or morphologically synchronized changes in yeast and wort constituents during the main fermentation as those realized in traditional bottom beer fermentations. The liquid nonabsorbent carrier particles used to fill the fermenter successfully promoted the fermentation of wort sugars, which were supplied from the top of the fermenter, by preventing their rapid sinking. In addition, the carrier particles displayed other benefits that result in effective operation. The quality of the harvested young beer was satisfactory, but had a low ester content that may be improved by further studies.
(和文要旨)
 安定かつ高い酵母活性を維持できるビール醸造の連続下面主発酵システムを設計し、その性能を評価した。基本的なストラテジーは、伝統的な下面ビールの発酵において実現されているように、主発酵中の麦汁成分と生理学・形態的に同調した酵母の変化を実現することである。発酵容器を満たすために使用した非浸透性の担体粒子は、発酵容器の上部から供給した麦汁の沈降を阻止し、麦汁糖類の発酵を促進した。加えて、担体粒子は、効果的操作に利点があった。製成若ビールの品質は満足できたが、更なる研究によって改善が必要な低エステル含量であった。
J. Am. Soc. Brew. Chem. 66(2), 80-87 (2008)】
Effect of Soy Peptide on Brewing Beer
(大豆ペプチドがビール下面酵母の増殖・醗酵に及ぼす影響)
Sayuri KITAGAWA, Nobuhiko MUKAI, Yuko FURUKAWA, Kanako ADACHI, Akihiro MIZUNO, and Haruyuki IEFUJI
(北川さゆり、向井伸彦、古川裕子、安達佳奈子、水野昭博、家藤治幸)
 We examined the effect of soy peptides (SPs) on the fermentation and growth of Yeast Bank Weihenstephan 34/70 (W34/70), a bottom-fermenting yeast. We compared fermentation for SP with that for a free amino acid (FAA) mixture having the same amino acid composition as SP, as a nitrogen source. Maltose syrup was used as a carbon source, and the medium contained excess amounts of essential minerals and vitamins. We observed that SP was better than FAA mixture at promoting fermentation and growth and that much more β-phenylethyl alcohol was produced during fermentation with SP than with FAA mixture. Subsequently, we compared fermentations with the FAA mixture and selected mixtures containing various dipeptides of Phe as a nitrogen source. We found that the rates of Phe metabolism and β-phenylethyl alcohol generation were much higher when Phe was presented as a dipeptide (Phe-Asp, Phe-Leu, or Phe-Phe) than when presented as FAA. These results show that amino acids such as Phe are absorbed more rapidly when presented as a peptide than as FAA, resulting in a more rapid production of β-phenylethyl alcohol.
(和文要旨)
 大豆ペプチドのビール下面酵母w34/70の増殖・醗酵に及ぼす影響を検討した。炭素源としてマルトースシロップを用い、炭素源・窒素源以外の酵母の増殖醗酵に必要な微量成分を大量に添加し、窒素源としてのSP 0.5%、及びSPと同アミノ酸組成のアミノ酸混合物(faa)の比較において、SPの方が増殖・醗酵とも若干良好であった。本実験の培養液中の香気成分含量を測定したところ、SP添加区の方がβ-フェネチルアルコール含有量が顕著に多くなっていた。
 また、遊離アミノ酸を所定の割合で混合したアミノ酸混合液を窒素源とした発酵試験で、フェニルアラニンを@遊離アミノ酸としてAジペプチドとして(Phe-Leu・Phe-Asp・Phe-Pheのいずれか)添加した際の比較において、ジペプチドとして添加した方がフェニルアラニン減少率及びβ-フェネチルアルコール産生量とも大きくなった。このことから、フェニルアラニンなどの、遊離アミノ酸の形では比較的取り込まれにくいアミノ酸種がペプチド態で存在する場合、遊離アミノ酸よりも取り込み速度が早く、その結果β-フェネチルアルコールに代謝されて放出されることが示唆された。
JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING 105 (4), 360-366 (2008)】
An acidic and thermostable carboxymethyl cellulase from the yeast Cryptococcus sp. S-2: Purification, characterization and improvement of its recombinant enzyme production by high cell-density fermentation of Pichia pastoris
Cryptococcus sp. S-2由来の酸性・耐熱性カルボキシメチルセルラーゼ:精製、性質、Pichia pastorisによる高密度培養による酵素生産性の改良)
Jantaporn Thongekkaew, Hiroko Ikeda, Kazuo Masaki, Haruyuki Iefuji
(ジャンタポーン・トンゲッカウ、池田博子、正木和夫、家藤治幸)
 The extracellular carboxymethyl cellulase (CSCMCase) from the yeast, Cryptococcus sp. S-2, was produced when grown on cellobiose. It was purified to homogeneity from the supernatant by ultrafiltration, DEAE- 5PW anion exchange column and TSK-Gel G3000SW gel filtration. The purified enzyme was monomeric protein with molecular mass of approximately 34 kDa. The optimum temperature and pH for the action of the enzyme were at 40-50℃ and 3.5, respectively. It was stable at pH range of 5.5-7.5 and retained approximately 50% of its maximum activity after incubating at 90℃ for 1 h. Moreover, it could able to hydrolyze carboxymethyl cellulose sodium salt higher than insoluble cellulose substrate such as Avicel, SIGMACELL and CM cellulose. Due to its action at acidic pH and moderately stable at high temperature, the gene encoding carboxymethyl cellulase (CSCMCase) was isolated and improved the enzyme yield by high cell-density fermentation of Pichia pastoris. The CSCMCase cDNA contains 1023 nucleotides and encodes a 341-amino acid. It was successfully expressed under the control of alcohol oxidase I promoter using methanol induction of P. pastoris fermentation in a 2L ABLE bioreactor. The production of the recombinant carboxymethyl cellulases was higher than that from Cryptococcus sp. S-2 of 657-fold (2.75 and 4.2 x10-3 mg protein L-1, respectively) indicating that the leader sequence of CSCMCase has been recognized and processed as efficiently by P. pastoris. Furthermore, the recombinant enzyme was purified in two-step of ultrafiltration and hydrophobic interaction chromatography which would be much more convenient for large-scale purification for successful industrial application.
(和文要旨)
 Cryptococcus sp. S-2由来のcarboxymethyl cellulase (CSCMCase)はセロビオースにより誘導され、分泌生産される。分泌された本酵素はDEAEイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーにより単一成分まで精製された。精製された酵素は分子量約34kDaの単量体であった。至適温度は40-50℃、至適pHは3.5であった。本酵素はpH5.5-7.5で安定であり、90℃1時間処理でも最大活性の50%の活性を保持していた。
 さらに、CSCMCase遺伝子も単離された。cDNAは1023塩基から構成され、341アミノ酸をコードしていた。組換えCSCMCaseは高密度培養下でPichia pastorisにより高生産された。P.pastorisのアルコールオキシダーゼプロモーター下流に本来のシグナル配列を有したCSCMCase遺伝子を連結し、メタノール誘導により培地中に分泌生産した。組換えCSCMCaseの生産性は、Cryptococcus sp. S-2による生産量の657倍であった。さらに、組換えCSCMCaseは限外ろ過と疎水性相互作用クロマトグラフィーの2ステップで精製できた。
Protein Expression and Purification 60,140-146(2008)】
Inhibition of Mitochondrial Fragmentation during Sake Brewing Causes High Malate Production in Sake Yeast
(酒造時におけるミトコンドリア断片化の抑制は清酒酵母における高リンゴ酸生産の原因となる)
Hiroshi Kitagaki, Taku Kato, Atsuko Isogai, Shigeaki Mikami, Hitoshi Shimoi,
(北垣 浩志、加藤 拓、三上 重明、下飯 仁)
 We previously demonstrated the presence and fragmentation of mitochondria during alcohol fermentation. Here, we show that Fis1p induces mitochondrial fragmentation, and inhibition of mitochondrial fragmentation causes higher malate production during sake brewing. These findings indicate that mitochondrial morphology affects the metabolism of constituents, providing a breeding strategy for high-malate-producing yeasts.
(和文要旨)
 以前,アルコール発酵時におけるミトコンドリアの存在および断片化を示した。今回,Fis1pはミトコンドリアの断片化を誘導し,ミトコンドリア断片化の抑制は,酒造時における高いリンゴ酸生産を起こすことを示した。これらの知見から,ミトコンドリアの形態は構成成分の代謝に影響し,高リンゴ酸生産酵母の育成戦略を提供することが分かった。
J. Biosci. Bioeng. 105(6), 675-678 (2008)】
2008/7/9 掲載


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