令和2年度 研究成果

3. 第3四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Aspergillus oryzae acetamidase catalyzes degradation of ethyl carbamate Aspergillus oryzaeのアセトアミダーゼはカルバミン酸エチルを分解する

著者
Kazuo Masaki, Kanako Fujihara, Dararat Kakizono, Taichi Mizukure, Masaki Okuda, Nobuhiko Mukai
正木和夫、藤原可菜子、柿薗ダララット、水呉太一、奥田将生、向井伸彦
要約

Urethanase (EC 3.5.1.75) catalyzes the hydrolysis of ethyl carbamate (EC) to ethanol, carbon dioxide, and ammonia. From our recent study, we expected that an acetamidase encoded by amdS of Aspergillus oryzae may catalyze the degradation of EC because it is homologous with a Candida parapsilosis urethanase (CPUTNase) recently identified. Urethanase is a prospective candidate to reduce EC in alcoholic beverages, but knowledge of this enzyme is very limited. Recombinant AmdS was expressed to study its enzymatic properties. Purified AmdS was identified as a homo-tetramer consisting of four 60 kDa units and exhibited urethanase activity. In a 20% ethanol solution, AmdS had 65% activity compared with a solution without ethanol. Residual activity after 18 h indicated that AmdS was stable in 0%–40% ethanol solutions. The optimum temperature of AmdS was 40°C. This enzyme showed urethanase activity at pH 6.4–9.6 and exhibited its highest activity at pH 9.6. The Km value of AmdS for EC was 8.2 mM, similar to the Km value (7.6 mM) of CPUTNase. AmdS showed activity not only for EC and acetamide but also other amide compounds. In this study, we investigated the enzymatic properties of AmdS that was identified as acetamidase and showed that an amidase can be an enzymatic candidate that degrades EC.

ウレタナーゼ(EC 3.5.1.75)は、カルバミン酸エチル(EC)をエタノール、二酸化炭素、アンモニアへの加水分解を触媒します。黄麹菌Aspergillus oryzaeamdSにコードされているアセトアミダーゼが、我々が最近調べた酵母Candida parapsilosis のウレタナーゼ (CPUTNase) と配列相同性があることから、この酵素がECを分解することを予測しました。ウレタナーゼは、アルコール飲料中のECを分解する有望な手段ですが、その研究例はまだ少ないのが現状です。本研究では、アセトアミダーゼの性質を明らかとするために、組換えAmdS発現させ、精製酵素の性質を調べました。AmdSは、60 kDaタンパク質の4分子からなるホモ四量体でした。20%エタノール中では、65%の活性を保持し、0-40%のエタノール中で18時間保持した場合でも、安定に存在しました。至適温度は40℃、pH6.4-9.6の間で活性を示し、pH9.6で最大活性を示しました。AmdSのECに対するKm 値は、8.2 mMであり、CPUTNase の7.6 mMと近い値を示しました。さらに、AmdSは、EC以外にも、様々なアミド化合物へ基質特異性を示しました。この研究では、以前にアセトアミダーゼと同定されたAmdSの酵素的性質を詳細に調べ、アミダーゼがEC分解の候補酵素としての可能性を示しました。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 130, 577-581 (2020)

2 Mutagenesis, breeding, and characterization of sake yeast strains with low production of dimethyl trisulfide precursor DMTS前駆物質低生産清酒酵母の育種と特性評価

著者
Jun Makimoto, Kou Wakabayashi, Toyohisa Inoue, Yuriko Ikeda, Ryoko Kanda, Atsuko Isogai, Tsutomu Fujii, Takashi Nakae
槙本純、若林興、井上豊久、池田優理子、神田涼子、磯谷敦子、藤井力、中江貴司
要約

Dimethyl trisulfide (DMTS) is one of the main components responsible for “hineka”, the aroma associated with deteriorated Japanese sake during storage. The molecule 1,2-dihydroxy-5-(methylsulfinyl)pentan-3-one (DMTS-P1) has been previously identified as a major precursor compound of DMTS. Furthermore, it had been suggested that the yeast methionine salvage pathway is involved in the production of DMTS-P1. In sake brewing tests, DMTS-P1 and the DMTS producing potential (DMTS-pp; DMTS amount of sake after accelerated storage) were significantly reduced in mde1 or mri1 strain, which lack genes of the methionine salvage pathway. Industrial use of the gene-disrupting strains may not be accepted in the Japanese food industry. In order to obtain mde1 or mri1 mutants, we established a method to screen 5’-methylthioadenosine (MTA) non-utilizing strains using minimum culture medium containing methionine or MTA by ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenesis with methionine-auxotrophic sake yeast haploid. As expected, mde1 and mri1 mutants were identified among the obtained mutants by an established screening method. The obtained strains had poor fermentation ability in sake brewing tests, so back-crossing was performed on the mutants to obtain mde1 or mri1 homozygous mutants. These strains had improved brewing characteristics, and DMTS-P1 and the DMTS-pp of the produced sake were significantly lower than those of the parent strains. These strains are expected to contribute to improving the maintenance of sake quality during storage.

ジメチルトリスルフィド(DMTS)は清酒の貯蔵劣化臭である老香の主要成分である。これまでに、DMTSの主要前駆体として1,2-dihydroxy-5-(methylsulfinyl)pentan-3-one (DMTS-P1)が同定されている。さらに、DMTS-P1の生成に酵母のメチオニン再生経路が関与し、そのメチオニン再生経路の遺伝子であるMRI1,MDE1のいずれかを破壊した株を用いることで清酒中のDMTS-P1及びDMTS生成ポテンシャル(DMTS-pp;強制劣化後のDMTS生成量)が顕著に減少することが明らかになっている。我々は産業利用には課題が多い遺伝子破壊株ではなく、突然変異によってMDE1, MRI1変異株を取得するため、メチオニン要求性の一倍体清酒酵母にethyl methanesulfonate (EMS) 変異処理を行い、 メチオニンまたは5’-methylthioadenosine(MTA)を含む最少培地を用いてMTA非資化性株をスクリーニングする方法を確立した。この方法により得られた変異株の中から、期待通りmde1, mri1変異株を取得できた。しかし清酒醸造試験において発酵能が悪かったため、これら変異株に対し戻し交雑を行いmde1,mri1ホモ変異接合株を取得した。取得した接合株は醸造特性も改善しており、製造した清酒のDMTS-P1,DMTS-ppは親株より顕著に低かった。これらの株は清酒保存中の品質保持の向上に資すると期待される。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 130, 610-615 (2020)

3 Effect of Cold Soak on Red Wine Making 赤ワインの初期低温醸しの効果

著者
Hideaki SHIMIZU,Minori KONO, Kazuya KOYAMA, Kazuhiro IWASHITA, Nami GOTO-YAMAMOTO
清水秀明,河野美乃里,小山和哉,岩下和裕,後藤奈美
要約

The effect of cold soak in pilot-scale and plant-scale vinification processes at various maceration temperatures was examined in nine wineries, and the produced wines were analyzed for chemical and sensory properties. Cold soak tended to increase total anthocyanins, color intensity, and total phenols (A280) of wine regardless of grape variety, when the temperatures for the cold soak and the subsequent maceration were controlled appropriately. The basic chemical components of wines were minimally affected by the cold soak. Total anthocyanins in the cold soak wines were higher than those in control wines, and some cold soak wines received favorable evaluation with regard to flavor, astringency, or body in the sensory analysis compared with control wines. The results indicate that cold soak carried out appropriately resulted in good coloration in many cases and had no deleterious effects.

海外や小規模試験において赤ワインの色の向上に効果があると報告のある初期低温醸しについて,日本ワインに用いられる様々な品種を用いてワイナリーで試験醸造を行いその効果を検証した.初期低温醸しやその後の温度条件が適切であった場合は,品種を問わず,総アントシアニン,Color Intensity,総フェノール(A280)が,通常の醸し方法と比べて高くなる傾向であった.総アントシアニンが向上したサンプルは官能評価においても,ワインの香り,渋味(収斂味),厚み(ボディ感)が通常醸しと比べて良いと評価される場合もある一方で,通常の醸造方法と顕著な差が認められない場合もあったが,概して劣る結果は認められなかった.

掲載雑誌
Journal of ASEV Japan, 31, 115-124 (2020)

4 Low-Dose Ethanol Has Impacts on Plasma Levels of Metabolites Relating to Chronic Disease Risk in SAMP8 mice SAMP8マウスにおける低用量エタノール摂取は慢性疾患リスクに関連する血漿代謝物レベルに影響を及ぼす

著者
Churan Fu, Yongshou Yang, Thanutchaporn Kumrungsee, Akiko Kimoto, Hanae Izu and Norihisa Kato
付楚然、楊永寿、カムランシータナッチャポーン、木本晶子、伊豆英恵、加藤範久
要約

The effects of low-dose alcohol on experimental animals are unclear. This study examined plasma metabolites in senescence-accelerated mice 8 (SAMP8) given lowdose ethanol, and compared them with aging progress and skeletal muscle strength. Male SAMP8 mice (10-wk-old) were given drinking water containing 0% (control), 1%, 2%, or 5% (v/v) ethanol for 14 wk. Compared with the control group, only mice who consumed 1% ethanol experienced a lower senescence score at 18 and 23 wk, as well as an increased limb grip strength at 21 wk. Plasma metabolites of control, 1% and 2% ethanol groups were analyzed by capillary electrophoresis–time-of-flight mass spectrometry (CE-TOF/MS). Among the 7 metabolites affected by ethanol, notewhorthy is the positive association of the ethanol levels in drinking water with the levels of α-ketoglutarate (antioxidant and anti-inflammatory metabolite) and hippurate (antioxidant and microbial co-metabolite) (p<0.05). Intriguingly, the levels of 2-hydroxyisobutyrate (the biomarker of energy metabolism and microbial co-metabolite) were higher in the 1% ethanol group (p<0.05), but not in the 2% ethanol group as compared to the control. Furthermore, the levels of some of the metabolites affected were correlated with some variables in the grading score of senescence and muscle strength. This study provides a novel insight into how low-dose ethanol in SAMP8 mice modulates the levels of circulating metabolites relating to chronic disease risk.

実験動物に対する低用量アルコールの摂取の影響は不明である。本研究では、低用量エタノールを投与した老化促進マウス8(SAMP8)の血漿代謝物を調べ、加齢の進行と骨格筋の強度と比較した。オスのSAMP8マウス(10週齢)に、0%(コントロール)、1%、2%、または5%(v / v)のエタノールを含む飲料水を14週間与えた。対照群と比較し、1%エタノールを摂取したマウスのみ、18週目と23週目で老化スコアが低くなり、21週目で四肢の握力が強かった。コントロール、1%および2%エタノール群の血漿代謝物をキャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析(CE-TOF / MS)によって分析した。エタノールの影響を受ける7つの代謝物のうち、飲料水中のエタノールとα-ケトグルタル酸(抗酸化および抗炎症代謝物)および馬尿酸(抗酸化および微生物共代謝物)に正相関がみられた(p<0.05)。興味深いことに、2-ヒドロキシイソ酪酸(エネルギー代謝と微生物共代謝物のバイオマーカー)が2%エタノール群ではなく、コントロールと比較して1%エタノール群(p<0.05)で高かった。さらに影響を受けたいくつかの代謝物は老化と筋力の評価スコアの変数のいくつかと相関が見られた。本研究はSAMP8マウスの低用量エタノール摂取が慢性疾患リスクに関連する血中代謝物レベルをどのように調節するか、新たな知見を提供する。

掲載雑誌
J Nutr Sci Vitaminol, 66, 553–560, 2020

2021/1/21 掲載

2. 第2四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 平成30酒造年度全国新酒鑑評会出品酒の分析について Analysis of Sake Components Presented to the Japan Sake Awards 2019

著者
山田修、藤田晃子、飯塚幸子、伊豆英恵、岸本徹、神田涼子、寺本聡子、後藤奈美
Osamu YAMADA, Akiko FUJITA, Sachiko IIZUKA, Hanae IZU, Toru KISHIMOTO, Ryoko KANDA, Satoko TERAMOTO, Nami GOTO-YAMAMOTO
要約

平成30酒造年度全国新酒鑑評会(第107回鑑評会)は、当該年度生産清酒を全国的に調査研究することにより、製造技術と酒質の現状及び動向を明らかにし、もって清酒の品質及び酒造技術の向上に資するとともに、国民の清酒に対する認識を高めることを目的として、日本酒造組合中央会との共催により実施した。

審査は、酒類総合研究所において、平成31年4月23日(火)から25日(木)の3日間に予審を行い、令和元年5月9日(木)及び10日(金)に決審を行った。また、5月29日(水)に東広島運動公園体育館で製造技術研究会を開催するとともに、6月15日(土)に日本酒造組合中央会主催の東京池袋のサンシャインシティ・文化会館展示ホールでの公開きき酒会を後援した。

出品は857点であった。審査の結果、優秀と認められた416点を入賞酒とし、さらに、決審において特に優秀と認められた237点に金賞を授与した。また、出品酒を公開する製造技術研究会及び公開きき酒会には、全国からそれぞれ、1,551人及び3,286人が来場した。

出品酒については、審査に加え酒質の現状及び動向を調査研究するため、出品者の記載による「全国新酒鑑評会出品酒調査表」の内容を集計するとともに、成分分析(「老ねやすさ」の受託分析を含む。)を行った。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 192, 1-17 (2020)

2 第42回本格焼酎・泡盛鑑評会について Review of the 42nd Honkaku Shochu and Awamori Contest in 2019

著者
向井伸彦、磯谷敦子、金井宗良、髙橋正之、長船行雄、山根善治、芳村俊広、後藤奈美
Nobuhiko MUKAI, Atsuko ISOGAI, Muneyoshi KANAI, Masayuki TAKAHASHIO, Yukio OSAFUNE, Yoshiharu YAMANE, Toshihiro YOSHIMURA, and Nami GOTO-YAMAMOTO
要約

単式蒸留焼酎の品質を全国的に調査研究することにより、製造技術と品質の現状及び動向を明らかにし、もって単式蒸留焼酎の製造技術及び品質の向上に資することを目的として、第42 回本格焼酎・泡盛鑑評会を日本酒造組合中央会と共催で開催した。今回から開催目的を改訂し、鑑評会が単式蒸留焼酎の製造技術及び品質の向上に資することを明確化した。

審査は令和元年6月 4日(火)及び6月5日(水)に行い、単式蒸留焼酎の製造に関与している者等が出品酒をきき酒する製造技術研究会は令和元年6月21日(金)に当研究所で開催し112名が参加した。

なお、輸出促進等に資する品質確保のために、第37回から分析を希望する出品者に対して有料でメタノールの受託分析を実施している。

出品状況、審査及び分析結果の概要について報告するとともに、尺度評価項目間の相関関係についても調べたので併せて報告する。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 192, 18-34 (2020)

3 全国地ビール品質審査会2020出品酒の分析について Analysis of Beer Components Presented to Craft Beer Contest of Japan Brewers Association in 2020

著者
伊藤伸一、矢澤彌、神本真紀、江村隆幸
Shinichi ITO, Hisashi YAZAWA, Maki KAMIMOTO and Takayuki EMURA
要約

全国地ビール品質審査会2020は、地ビールの醸造技術向上及び品質改善を目的として、全国地ビール醸造者協議会(Japan Brewers Association)の主催により実施しており、本年で4回目となる。本年においては45社から106点の出品があり、品質審査会を令和2年3月11日(水)及び12日(木)に、公益財団法人日本醸造協会赤レンガ酒造工場(東京都北区滝野川)で実施する予定であったが、新型コロナウイルス感染症拡大防止の観点から中止となった。出品酒については、令和2年2月から4月の期間において、独立行政法人酒類総合研究所において成分分析及び微生物検査を実施したので、その結果について報告する。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 192, 35-39 (2020)

4 官能評価訓練用ワインフレーバーサンプルの作成 Formulation of Wine Flavor Samples for Sensory Evaluation Training

著者
藤田晃子、後藤奈美
Akiko FUJITA, Nami GOTO-YAMAMOTO
要約

ワインの特徴香やオフフレーバーを適切に識別し、評価することは、ワインの官能評価を行うために不可欠な能力であり、効果的な官能評価訓練を行うためにはこれらの香気成分を示すサンプル作成が重要である。現在、市販のワインフレーバーサンプルには、小さい瓶から香りを嗅ぐタイプの製品や、カプセルに入った香気成分をワイン1本に添加する製品等がある。しかし、研修会などである程度の人数が一度に使用するには、水、アルコール溶液またはワインに香気成分を添加したサンプルが適しており、さらにサンプル量や濃度が調節できることが望ましい。そこで、試薬として入手できる香気成分を用いて官能評価訓練用の標準的な濃度を決め、その1000倍濃度の原液を、必要な場合に使用したり分譲したりできるようスクリューキャップ付きのバイアルに分注して冷凍保存することとした。また、ワインを用いて酸化臭や日光臭のサンプルを作成する際の標準的な方法を定めた。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 192, 40-45 (2020)

5 Food safety evaluation of Aspergillus oryzae species based on the regulation by Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Japan 農林水産省が定める優先的にリスク管理を行うべきカビ毒のリストに基づいたAspergillus oryzae 種の安全性評価

著者
Sharon Marie Bahena-Garrido, Ryota Saito, Yuko Komatsu, Shiori Kodama, Ken Oda and Kazuhiro Iwashita
シャロン マリエ バヘナ-ガリド、齊藤亮太、小松夕子、児玉詩織、織田健、岩下和裕
要約

Based on the tandem approach of DI-HRMS and LC-QTOF-MS/SIM(and MS/MS), we could finally conclude that no significant traces of harmful secondary metabolites or mycotoxins found in all of the 13 Aspergillus oryzae industrial strains cultivated under different culture conditions. We further confirmed the safety of these Aspergillus oryzae strains for industrial production of fermented foods and beverages.

麴菌は安全な菌株であると考えられており、アフラトキシンの非生産性については、多様な菌株で詳細に研究がなされ、遺伝子のレベルで非生産性が確認されている。しかし、農水省が優先的にリスク管理を進めるカビ毒について、麴菌群全体での生産性について解析した例は少ない。麴菌群はゲノムアレイに基づいた系統解析により13の系統に分かれる。そこで麴菌群全体の生産性について検討するために、我々は各系統から1株ずつ選抜し、米麴や醤油麹を含む11の培養条件により、農水省が優先的にリスク管理を進める15のカビ毒について生産の有無を確認した。本解析では、DI-HRMSを利用することにより、非生産株・条件を効率的に排除した。さらに、カビ毒と精密質量が一致したものについては、LC-QTOFMS/SIM解析を行い、溶出時間と精密質量による検出を行ない、両者が一致したものについては、さらにMS/MS解析を行った。この結果、全てのカビ毒について、全ての菌株、培養条件で検出されなかった。

掲載雑誌
酒類総合研究所報告, 192, 46-57 (2020)

6 Effect of light on carotenoid and lipid production in the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides 油脂酵母Rhodosporidium toruloidesのカロテノイドと脂質生産における光の影響

著者
Khanh Dung Pham, Yosuke Shida, Atsushi Miyata, Takeru Takamizawa, Yoshiyuki Suzuki, Satoshi Ara, Harutake Yamazaki, Kazuo Masaki, Kazuki Mori, Sachiyo Aburatani, Hideki Hirakawa, Kosuke Tashiro, Satoru Kuhara, Hiroaki Takaku and Wataru Ogasawara
カーン・ダン・ファム、志田洋介、宮田淳史、高見沢健留、鈴木義之、荒学志、山崎晴丈、正木和夫、森一樹、油谷幸代、平川英樹、田代康介、久原哲、高久洋暁、小笠原渉
要約

The oleaginous yeast Rhodosporodium toruloides is receiving widespread attention as an alternative energy source for biofuels due to its unicellular nature, high growth rate and because it can be fermented on a large-scale. In this study, R. toruloides was cultured under both light and dark conditions in order to understand the light response involved in lipid and carotenoid biosynthesis. Our results from phenotype and gene expression analysis showed that R. toruloides responded to light by producing darker pigmentation with an associated increase in carotenoid production. Whilst there was no observable difference in lipid production, slight changes in the fatty acid composition were recorded. Furthermore, a two-step response was found in three genes (GGPSI, CAR1, and CAR2) under light conditions and the expression of the gene encoding the photoreceptor CRY1 was similarly affected. Light effect on carotenoid production in Rhodosporidium toruloides

酵母Rhodosporidium toruloidesのカロテノイドや脂質の生産における光応答を調べるために、光の有無の条件で培養を行なった。表現型と遺伝子発現解析から、酵母は光に応答して、カロテノイド生産に関係する濃い色の色素を生産した。一方、脂質の生産には光は関与しなかった。さらに、光の照射条件では、3つの遺伝子(GGPSI, CAR1, and CAR2) の2ステップの反応が見られた。

掲載雑誌
BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, 84, 1501-1512 (2020)

7 New urethanase from the yeast Candida parapsilosis 酵母Candida parapsilosis由来、新規ウレタナーゼ(カルバミン酸エチル分解酵素)

著者
Kazuo Masaki, Taichi Mizukure, Dararat Kakizono, Kanako Fujihara, Tsutomu Fujii, Nobuhiko Mukai
正木和夫、水呉太一、柿薗ダララット、藤原可菜子、藤井力、向井伸彦
要約

Urethanase (EC 3.5.1.75) is an effective enzyme for removing ethyl carbamate (EC) present in alcoholic beverages. However, urethanase is not well studied and has not yet been developed for practical use. In this study, we report a new urethanase (CPUTNase) from the yeast Candida parapsilosis. Because C. parapsilosis can assimilate EC as its sole nitrogen source, the enzyme was extracted from yeast cells and purified using ion-exchange chromatography. The CPUTNase was estimated as a homotetramer comprising four units of a 61.7 kDa protein. In a 20% ethanol solution, CPUTNase had 73% activity compared with a solution without ethanol. Residual activity after 18 h indicated that CPUTNase was stable in 0%-40% ethanol solutions. The optimum temperature of CPUTNase was 43℃. This enzyme showed urethanase activity at pH 5.5-10.0 and exhibited its highest activity at pH 10. The gene of CPUTNase was identified, and a recombinant enzyme was expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Characteristics of recombinant CPUTNase were identical to the native enzyme. The putative amino acid sequence indicated that CPUTNase was an amidase family protein. Further, substrate specificity supported this sequence analysis because CPUTNase showed higher activities toward amide compounds. These results suggest that amidase could be a candidate for urethanase. We discovered a new enzyme and investigated its enzymatic characteristics, sequence, and recombinant CPUTNase expression. These results contribute to a further understanding of urethanase.

ウレタナーゼ(EC 3.5.1.75)は、アルコール飲料に含まれるカルバミン酸エチル(EC)を取り除くのに有効な酵素です。しかしながら、これまでにあまり研究されておらず、実用品もまだ開発されていません。この研究では、酵母Candida parapsilosis由来の新規ウレタナーゼ(CPUTNase)を報告します。この酵母は、ECを単独窒素源として資化できるので、目的の酵素はその状態の酵母細胞内より抽出、イオン交換クロマトグラフィーで抽出しました。CPUTNaseは、61.7 kDaタンパク質の4分子からなるホモ四量体でした。20%エタノール中では、73%の活性を保持し、0-40%のエタノール中で18時間保持した場合でも、安定に存在しました。至適温度は43℃、pH5.5-10の間で活性を示し、pH10で最大活性を示しました。CPUTNaseの遺伝子も同定し、酵母Saccharomyces cerevisiaeにて組換え酵素として発現できました。この組換え酵素の性質は、本来の酵素と同じものだと確認できました。予想されるアミノ酸配列から、CPUTNaseはアミダーゼファミリーの酵素だと推測されました。CPUTNaseは、アミド化合物に高い活性を示し、この基質特異性からも、この配列解析の予想を支持することができました。我々はこの研究で、この新しい酵素を発見し、酵素の性質を調べ、配列解析、組換え酵素の生産を示しました。これらの結果は、ウレタナーゼのさらなる理解に貢献するものです。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 130, 115-120 (2020)

8 Variation in the mineral composition of wine produced using different winemaking techniques 製造方法の違いによるワインのミネラル組成の変動

著者
Hideaki Shimizu, Fumikazu Akamatsu, Aya Kamada, Kazuya Koyama, Kazuhiro Iwashita, and Nami Goto-Yamamoto
清水秀明、赤松史一、鎌田綾、小山和哉、岩下和裕、後藤奈美
要約

It has been reported that the concentrations of minerals in wines can be used to discriminate their geographical origin. However, some winemaking techniques may also affect the mineral concentration of the final product. In this study, we examined the effects of various winemaking techniques, including (i) fining, (ii) aging with oak tips, (iii) maceration with grape skins, (iv) chaptalization and acidification, and (v) yeast nutrient addition for alcohol fermentation, on the concentration of 18 minerals (Li, B, Na, Mg, Si, P, S, K, Ca, Mn, Co, Ni, Ga, Rb, Sr, Mo, Ba and Pb) in a total of 154 wine samples using grapes from different production areas. Among the various winemaking techniques, maceration with grape skin had the largest effect on mineral content, significantly changing the concentrations of 17 or 18 elements (B, Na, Mg, Si, P, S, K, Ca, Mn, Co, Ni, Ga, Rb, Sr, Mo, Ba and Pb). Fining treatment using bentonites had the second largest effect, altering the concentrations of 14 elements (Li, B, Na, Si, P, S, Ca, Co, Ga, Rb, Sr, Mo, Ba and Pb). However, in principal component analysis using all data (n=154), the wine samples were clearly clustered according to grapes used in the experiments rather than the winemaking technique. In conclusion, some winemaking techniques significantly altered the concentration of some minerals in wine; however, the principal factor influencing wine mineral composition seems to be its geographical origin.

ワインに含まれる無機成分濃度は、産地を識別するのに有用である可能性があるものの、製造工程での各種操作によって変動するとの報告もある。そこで、(i) 滓下げ、(ii) オークチップによる貯蔵、 (iii) 醸し、(iv) 補糖・補酸、(v) 発酵助成剤の違いによる無機成分濃度の変動の程度を、様々な産地のブドウを用いた154サンプルの18元素(Li, B, Na, Mg, Si, P, S, K, Ca, Mn, Co, Ni, Ga, Rb, Sr, Mo, Ba, Pb)を用いて調べた。様々な製造方法の中で、醸しが17-18元素濃度を有意に変化させ、最も大きな影響があった。次に、滓下げ剤であるベントナイトを添加した実験の影響が大きく、14元素濃度を有意に変化させた。しかし、本実験で用いた全154サンプルの18元素を基にした主成分分析を実施したところ、製造方法の違いより、今回用いたブドウ毎に分布する結果であった。つまり、製造方法によってはいくつかの無機成分濃度を有意に変化させるものの、ワインの無機成分組成に影響を与える主要因は産地である可能性が示唆された。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 130, 166-172 (2020)

2020/10/8 掲載

1. 第1四半期研究成果情報について

(1) 研究成果

1 Evaluating the influence of temperature on proanthocyanidin biosynthesis in developing grape berries (Vitis vinifera L.) ブドウ果粒生育中のプロアントシアニジン生合成に及ぼす温度の影響の評価

著者
Puspa Raj POUDEL, Kazuya KOYAMA, Nami GOTO-YAMAMOTO
プスパ・ラジ・ポウデル、小山和哉、後藤(山本)奈美
要約

The variability in grape (Vitis vinifera L.) proanthocyanidin content is largely attributable to viticultural and environmental conditions. However, the particular effect temperature has on proanthocyanidin biosynthesis is poorly understood. The aim of the present study was to ascertain the magnitude of the effect of temperature on proanthocyanidin biosynthesis in Cabernet Sauvignon grape berries cultured in vitro. In addition, the effects of temperature on global gene transcription were evaluated, and the microarray data were later validated by quantitative real-time PCR (qPCR). The grape berries used in this research were sampled 3-4 weeks after full bloom and cultured in vitro either under a low (20 ℃) or high (30 ℃) temperature treatment for 15 days (d) with sampling occurring every five days. The proanthocyanidin content was higher in the skin and seeds of grape berries cultured at a low temperature compared with a high temperature. However, overall proanthocyanidin composition between the treatments was not significantly affected. Microarray data revealed a total of 1298 genes with ≥ 3.5-fold expression differences under high temperature conditions. High temperature also inhibited the expression level of key genes involved in proanthocyanidin biosynthesis, anthocyanidin reductase (ANR) and leucoanthocyanidin reductase-1 (LAR-1) within the berry skin. However, the transcriptomic accumulation of transcription factors, such as VvMybPAs, VvMyb5a and VvMyb5b, was barely influenced during the peak expression of ANR and LAR-1. Thus, the present study revealed that temperature has a significant effect on proanthocyanidin biosynthesis in grape during berry development through enhancing the expression of key biosynthetic genes.

ブドウ(Vitis vinifera L.)のプロアントシアニジン含有量は、ブドウの栽培条件・環境条件によって大きく変動する。ただし、温度がプロアントシアニジン生合成に及ぼす影響はあまり理解されていない。そこで本研究では、in vitroで培養したカベルネ・ソーヴィニヨンのブドウ果粒のプロアントシアニジン生合成に対する温度の影響を明らかにすることを目的とした。さらに、包括的な遺伝子転写に対する温度の影響をマイクロアレイで評価し、定量的リアルタイムPCR(qPCR)で検証した。満開の3~4週間後にサンプリングしたブドウ果粒を、低温(20℃)または高温(30℃)の温度条件で15日間 in vitroで培養し、5日ごとにサンプリングした。プロアントシアニジン含有量は、低温で培養されたブドウ果実の果皮と種子の方が高かった。ただし、全体的なプロアントシアニジン組成は有意な影響を受けなかった。マイクロアレイデータにより、温度条件間で3.5倍以上の発現差がある合計1298個の遺伝子が明らかになった。高温によって、果皮のプロアントシアニジン生合成に関与する重要な遺伝子、アントシアニジンレダクターゼ(ANR)およびロイコアントシアニジンレダクターゼ-1(LAR-1)の発現レベルが低下した。ただし、VvMybPAsVvMyb5aVvMyb5bなどの転写因子のmRNAレベルは、ANRLAR-1のピーク発現中にほとんど影響を受けなかった。したがって、本研究は、温度が生合成遺伝子の発現に影響することにより、ブドウ果実生育中のプロアントシアニジン生合成に有意な影響を与えることを明らかにした。

掲載雑誌
Molecular Biology Reports, 47, 3501-3510 (2020)

2 Separation and Purification of Glucose in Sake for Carbon Stable Isotope Analysis 炭素安定同位体比分析のための清酒中グルコースの分離精製

著者
Fumikazu AKAMATSU, Yukari IGI, Akiko FUJITA
赤松史一、伊木由香理、藤田晃子
要約

An existing procedure for the separation and purification of glucose in sake for compound-specific carbon stable isotope analysis was examined with a view to reducing the sample amount required and process complexity, with a focus on the freeze-drying, solid-phase extraction (SPE), and high-performance liquid chromatography (HPLC) steps. In the revised procedure, the carbon stable isotopic composition, as indicated by δ13C values, of glucose was not significantly affected by glucose concentration in the range 0.25-1.00 mg mL-1, solvent (water or 80% aqueous acetonitrile), or HPLC procedure. Glucose freeze-dried after separation and purification by SPE and HPLC exhibited procedure-induced carbon isotopic discrimination of ≤ 0.1‰. The isolation procedure achieved the same accuracy in glucose δ13C values as that achieved with traditional ion-exchange procedures while requiring a sample volume (1 mL) only 4% that of the usual volume. The improved method enables cost-effective, labor-efficient, small-scale, compound-specific carbon stable isotope analyses of glucose in sake.

凍結乾燥、固相抽出(SPE)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の各処理過程を中心に、必要試料量の低減と処理過程の簡素化を目的として、炭素安定同位体比分析のための清酒中グルコースの分離精製方法を検討した。その結果、δ13C値で表したグルコースの炭素安定同位体比は、グルコースの濃度(0.25-1.00 mL-1)、溶液(水、80%アセトニトリル水溶液)、HPLC精製過程による有意な影響を受けないことがわかった。SPEによる分離、HPLCによる精製後、凍結乾燥したブドウ糖は、炭素同位体分別が0.1‰以下だった。この方法は、従来のイオン交換樹脂を用いた方法と同水準のグルコースの正確なδ13C値が得られ、分析に必要な試料量を従来の4%にまで低減できた。改良された分離精製方法は、清酒中グルコースの炭素安定同位体比分析の費用対効果の向上、省力化、小規模化を可能にする。

掲載雑誌
Food Analytical Methods, 13 (4), 885-891 (2020)

3 Characteristic analysis of the fermentation and sporulation properties of the traditional sake yeast strain Hiroshima no.6 伝統的な清酒酵母である「広島6号」の発酵特性及び胞子形成特性の解析

著者
Risa Yamasaki, Tetsuya Goshima, Kenji Oba, Atsuko Isogai, Ritsushi Ohdoi, Dai Hirata, Takeshi Akao
山﨑梨沙、五島徹也、大場健司、磯谷敦子、大土井律之、平田大、赤尾健
要約

General sake yeasts (e.g., Kyokai no.7, K7) show high fermentation ability and low sporulation frequency. Former is related to stress-response defect due to the loss-of-function of MSN4 and RIM15. Later is mainly caused by low IME1 expression, leading to difficulty in breeding and genetic analysis. Sake yeast Hiroshima no.6 (H6), which had been applied for sake fermentation, has sporulation ability. However, its detailed properties have not been unveiled. Here we present that the fermentation ability of H6 is suitable for sake brewing, and the precursor of dimethyl trisulfide in sake from H6 is low. MSN4 but not RIM15 of H6 has the same mutation as K7. Our phylogenetic analysis indicated that H6 is closely related to the K7 group. Unlike K7, H6 showed normal sporulation frequency in a partially RIM15-dependent manner, and IME1 in H6 was expressed. H6 possesses excellent properties as a partner strain for breeding by crossing.

一般的な清酒酵母(例:協会7号(K7))は、高い発酵能力と低い胞子形成頻度を示す。前者は、MSN4およびRIM15の機能欠損変異によるストレス応答の欠損との関連が報告されている。後者は、主にIME1発現の低下が一因であることが報告されているが、胞子形成欠損により交配育種と遺伝解析が困難となる。以前清酒の発酵に使用されていた清酒酵母広島6号(H6)は、胞子形成能を有しているが、その詳細な特性は明らかにされていなかった。本論文で私たちは、小規模清酒製造試験を行い、H6の発酵能力が清酒醸造に適していることと、H6の製成酒のジメチルトリスルフィドの前駆体が低いことを示した。H6のRIM15はK7と同様の機能欠失変異はなく、H6のMSN4はK7と同じ機能欠失変異を有した。さらに、系統解析により、H6はK7グループと遺伝的に近縁であることが明らかとなったが、K7とは異なり、H6は部分的にRIM15依存的に正常な胞子形成頻度を示し、H6のIME1は正常な発現を示した。 H6は交配による育種のパートナー株として優れた特性を持っている。

掲載雑誌
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 84 (4), 842-853 (2020)

4 The sake yeast YHR032W/ERC1 allele contributes to the regulation of the tetrahydrofolate content in the folate synthetic pathway in sake yeast strains 清酒酵母型Erc1は清酒酵母の葉酸合成経路におけるテトラヒドロ葉酸の含量を制御している

著者
Muneyoshi Kanai, Tomoko Kawata, Tomoko Morimoto, Masaki Mizunuma, Daisuke Watanabe, Takeshi Akao, Tsutomu Fujii, Haruyuki Iefuji
金井宗良、河田知子、森本朋子、水沼正樹、渡辺大輔、赤尾健、藤井力、家藤治幸
要約

To elucidate the mechanism underlying tetrahydrofolate (THF) accumulation in sake yeast strains compared with that in laboratory yeast strains, we performed a quantitative trait locus (QTL) analysis. The results revealed that the sake yeast ERC1 allele contributes to an increase in the ratio of THF to the total folate content in sake yeast.

清酒酵母における葉酸高蓄積機構を解明するために、量的形質遺伝子座(QTL)解析を行った。結果、清酒酵母が持つS-アデノシルメチオニン(SAM)高蓄積能の主な原因変異である清酒酵母型Erc1のフレームシフト変異(N545I)が、清酒酵母の葉酸高蓄積機構にも深く関与していることが示唆された。

掲載雑誌
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 84 (5), 1073-1076 (2020)

5 Efficacy of a long term feeding of α-glycerophosphocholine on aging-related phenomena in old mice 老齢マウスの加齢関連現象に対するα-グリセロホスホコリン長期摂取の効果

著者
Masataka NARUKAWA, Aya KAMIYOSHIHARA, Hanae IZU, Tsutomu FUJII, Kiminori MATSUBARA, and Takumi MISAKA
成川真隆、上吉原絢、伊豆英恵、藤井力、松原主典、三坂巧
要約

α-Glycerophosphocholine (GPC) is a natural source of choline. It reportedly prevents aging-related decline in cognitive function, but the underlying mechanism remains unclear. Although it is understood that aging influences taste sensitivity and energy regulation, whether GPC exerts antiaging effects on such phenomena requires further elucidation. Here, we used old C57BL/6J mice that were fed a GPC-containing diet, to investigate the molecular mechanisms underlying the prevention of a decline in cognitive function associated with aging and examine the beneficial effects of GPC intake on aging-related phenomena, such as taste sensitivity and energy regulation. We confirmed that GPC intake reduces the aging-related decline in the expression levels of genes related to long-term potentiation. Although we did not observe an improvement in aging-related decline in taste sensitivity, there was a notable improvement in the expression levels of β-oxidation-associated genes in old mice. Our results suggest that the prevention of aging-related decline in cognitive function by GPC intake may be associated with the improvement of gene expression levels of long-term potentiation. Furthermore, GPC intake may positively influence lipid metabolism.

α-グリセロホスホコリン(GPC)は天然のコリン源である。加齢による認知機能低下を防ぐことが知られているが、メカニズムは不明である。一方、老化は味覚感受性やエネルギー調節に影響を与えることが知られているが、GPCにこれらの老化防止効果があるかはさらなる解明が必要である。本研究では、GPCを含む食餌を与えた老齢C57BL / 6Jマウスを用い、加齢による認知機能低下予防の分子メカニズムを調べ、GPC摂取による味覚感受性やエネルギー調節などの加齢関連現象改善を検討した。記憶の長期増強関連遺伝子発現レベルの加齢にともなう減少がGPC摂取で抑制されることを確認した。加齢による味覚感度低下の改善はみられなかったが、肝臓のβ酸化関連遺伝子発現レベルが顕著に改善した。我々の結果はGPC摂取による加齢に伴う認知機能低下抑制が長期増強遺伝子発現レベルの改善と関連し、GPC摂取が脂質代謝に良い影響を及ぼすことを示唆している。

掲載雑誌
Gerontology, 2020, 66: 275-285.

6 Long-term Responses to Climate Change of the Carbon and Oxygen Stable Isotopic Compositions and Gelatinization Temperature of Rice 米の炭素及び酸素安定同位体比と糊化温度の気候変動への長期応答

著者
Fumikazu AKAMATSU, Masaki OKUDA, Tsutomu FUJII
赤松史一、奥田将生、藤井力
要約

The stable isotopic compositions of carbon (δ13C) and oxygen (δ18O) in rice are often used to confirm its authenticity. The gelatinization temperature is a crucial factor in alcoholic fermentation. However, little is known about the isotopic and thermal responses of rice to climate change. We show that in sake rice grown annually in the same paddy field from 1994 to 2013, the δ13C (-27.4‰ to -25.9‰) and δ18O values (20.4‰ to 27.0‰) correlated negatively with the mean daily minimum air temperature and precipitation, and positively with the hours of sunshine during grain-filling. In contrast, of the air temperatures tested, the gelatinization temperature of the rice grains (63.2 ℃ to 70.0 ℃) correlated positively and most strongly with the mean daily mean air temperature. Thus, we identified the mean daily minimum temperature during grain-filling, a nocturnal temperature, as a major factor affecting the isotopic and thermal variations in rice grains.

米の炭素(δ13C)及び酸素安定同位体比(δ18O)は、その信頼性確保のためにしばしば利用される。醸造においては糊化温度が重要要素となっている。しかし、米の安定同位体比と糊化温度の気候変動への応答には不明な点も多い。本研究では、1994年から2013年まで同じ水田で栽培した酒造好適米について、δ13C値(-27.4‰から-25.9‰)とδ18O値(20.4‰から27.0‰)が、登熟期間の平均日最低気温及び降水量と負の相関があり、日照時間と正の相関があること、米の糊化温度(63.2 ℃から70.0 ℃)は、気温と正の相関があり、中でも平均日平均気温と最も強く相関していたことを見出した。登熟期の夜間気温を反映した平均日最低気温が、米の安定同位体比と糊化温度の主要な変動要因であることを明らかにした。

掲載雑誌
Food Chemistry, 315, 126239 (2020)

7 Invasive growth of Aspergillus oryzae in rice koji and increase of nuclear number 米麹中での麹菌の菌糸成長と核の増加

著者
Mizuki Yasui, Ken Oda, Shunsuke Masuo, Shuji Hosoda, Takuya Katayama, Jun-ichi Maruyama, Naoki Takaya and Norio Takeshita
安井瑞稀、織田健、桝尾俊介、細田柊志、片山琢也、丸山潤一、高谷直樹、竹下典男
要約
Background

'Rice koji' is a solid culture of Aspergillus oryzae on steamed rice grains. Multiple parallel fermentation, wherein saccharification of rice by A. oryzae and alcohol fermentation by the budding yeast occur simultaneously, leads to the formation of a variety of ingredients of Japanese sake. In sake brewing, the degree of mycelial invasive growth into the steamed rice, called 'haze-komi', highly correlates with the digestibility and quality of rice koji, since the hyphae growing into the rice secrete amylases and digest starch.

Results

In this study, we investigated mycelial distribution of GFP-tagged A. oryzae in rice koji made with different types of rice, such as sake rice and eating rice, with 50 or 90% polishing rate to remove abundant proteins and lipids near the surface. In addition, we compared transcriptomes of A. oryzae in the different types of rice koji. Finally, we found that A. oryzae increases the nuclear number and hyphal width in the course of 1-3 days cultivation.

Conclusions

Our imaging analyses indicate that A. oryzae hyphae grew more deeply into 50% polished rice than 90% polished rice. The increases of nuclear number may be a selectively acquired characteristic for the high secretory capacity during the long history of cultivation of this species.

背景

米麹は、蒸米上に麹菌を固体培養したものである。並行複発酵では、麹菌による米の糖化と酵母によるアルコール発酵が同時に起こり、日本酒の多様な成分を作り上げる。日本酒醸造では、米粒中に侵入した麹菌菌糸からアミラーゼを分泌してデンプンを分解することから、破精込みと呼ばれる蒸米への菌糸の侵入が米麹の品質と糖化能に関係している。

結果

本研究では、表層の豊富なタンパク質や脂質を除くために50%、90%精米歩合で精米した酒米や食用米で製麹を行い、米麹中にてGFPで標識された麹菌の分布を調べた。さらに条件の異なる米麹中で発現している遺伝子の転写状況を比較した。麹菌は、培養3日間で核の数を増やし、菌糸の幅が増加していた。

結論

麹菌は、90%精米よりも50%精米した米でより深く菌糸が破精込んでいることを可視化して示した。核の増加が観察され、麹菌が長い培養の歴史を通じて高いタンパク質分泌能を得るために選択的に獲得した形質である可能性が示された。

掲載雑誌
Fungal Biology and Biotechnology, 7, 8 (2020)

8 Development of sake yeast haploid set with diverse brewing properties using sake yeast strain Hiroshima no. 6 exhibiting sexual reproduction. 清酒酵母広島6号の有性生殖能を活用した、多様な醸造特性を持つ清酒酵母一倍体セットの開発

著者
Risa Yamasaki, Tetsuya Goshima, Kenji Oba, Muneyoshi Kanai, Ritsushi Ohdoi, Dai Hirata, Takeshi Akao
山﨑梨沙、五島徹也、大場健司、金井宗良、大土井律之、平田大、赤尾健
要約

Among sake yeast strains, Kyokai no. 7 (K7) and its closely related strains (K7 group) are predominantly used because of their excellent brewing properties. In the sake industrial sector, the need for various types of yeast strains is high. Although crossbreeding is an effective method for generating genetic diversity that should result in diverse characteristics, most K7 group strains lack normal sporulation ability, including the ability to undergo meiotic chromosomal recombination, which leads to difficulties in crossbreeding. Accordingly, the improvement of sake yeast strains primarily depends on mutagenesis and suitable selection in a stepwise manner. Our recent study revealed that the long-preserved sake yeast strain Hiroshima no. 6 (H6) does not belong to the K7 group despite genetically being extremely similar. In addition, H6 exhibited normal sporulation. Thus, we isolated haploid cells from H6 and mated them with previously isolated haploid cells of K7 group strains. The crossbred diploid strains had normal sporulation ability; hence, we performed tetrad analysis. The brewing characteristics of the obtained haploid set were extremely diverse. Principal component analysis based on the volatile and organic acid components measured using small-scale sake brewing tests revealed that the haploid strains derived from each diploid strain displayed a characteristic distribution. Thus, we demonstrated the availability of genetic crossbreeding using H6 with sporulation ability to facilitate both the development of novel sake yeast strains with many desirable characteristics and analyses of the function of sake yeast.

清酒酵母のうち、協会 7号(K7)およびその近縁株(K7グループ)は、優れた醸造特性を有していることから主要な株として清酒醸造に使用されている。清酒製造においては様々な醸造特性を有した菌株への要望が高い。交配は多様な特性をもたらす遺伝的多様性を生み出すための効果的な方法だが、ほとんどのK7グループ株は、減数分裂時の染色体組換えの異常を含む胞子形成能力が欠損しており、交配による育種は難しいことが知られている。したがって、新規清酒酵母株の育種は、主に段階的な突然変異誘発と薬剤耐性株の取得に依存している。我々の最近の研究により、清酒酵母広島6号(H6)はK7グループと遺伝的に非常に近縁であるが、厳密にはK7グループに属していないこと、また、正常な胞子形成能を有することを明らかにした。このことから、H6から半数体細胞を分離し、以前に分離されたK7グループ株の半数体細胞と交配を行った。交雑二倍体株は正常な胞子形成能力を有したことから、交雑二倍体を用いて四分子分析を行ったところ、得られた半数体セットは非常に多様な醸造特性を有していた。実験室規模の清酒小仕込み試験を行い、得られた製成酒の揮発性香気成分組成および有機酸組成に基づく主成分分析により、各交雑二倍体株に由来する半数体株が特徴的な分布を示すことが明らかになった。本報告では、胞子形成能力を備えたH6を使用して、多くの望ましい特性を備えた新規清酒酵母株の開発と清酒酵母の特有の機能解析の両方を促進する遺伝的交配の利用可能性を実証した。

掲載雑誌
Journal of Bioscience and Bioengineering, 129 (6), 706-714 (2020)

2020/7/6 掲載